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摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)分离自小鼠的囊胚内细胞团,在体外具有无限的自我更新能力和多向分化的潜能,因此拥有重大的社会和经济效益.前期人们发现,DNA结合抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1,IdI)在含血清培养条件下,可以促进mESCs自我更新,但其家族成员,如Id2和Id3,在mESCs中的作用尚不清楚.本课题在mESCs里分别上调Id2和Id3基因的表达,发现它们在含血清的培养条件下均具有促进mESCs自我更新的能力,但Id2促进自我更新的能力大于Id3.通过转录组测序技术发现Id2上调c-Myc和n-Myc基因的表达水平.最后功能性验证实验证实,只有同时干扰c-Myc和n-Myc基因的表达才能够极大地削弱Id2维持mESCs未分化状态的作用,表明Id2主要通过诱导Myc家族成员的表达来促进mESCs的自我更新.本研究结果将扩大人们对于细胞多能性调控网络的认识,利于干细胞未来的基础研究和安全应用....
[专利] 发明专利 CN201611222004.X
安徽大学 2017-07-14
摘要:本发明公开了一种比率型双光子甲醛荧光探针及其制备方法和用途,其中比率型双光子甲醛荧光探针的结构如下:本发明荧光探针分子在甲醛与其他醛类、氨基酸等分子共存的体系中,对甲醛表现出较高的选择性和灵敏性。细胞毒性测试表明本发明荧光探针分子对细胞几乎没有毒性作用,双光子荧光显微成像实验表明本发明荧光探针分子对MCF‑7细胞的细胞渗透性良好,适用于细胞内检测甲醛分子的存在。
[专利] 发明专利 CN201611103203.9
安徽大学 2017-04-26
摘要:本发明公开了一种细胞自噬监测探针及其制备方法和用途,其细胞自噬监测探针的结构如下:通过细胞共定位实验确定其能专一的定位于溶酶体上,双光子荧光显微成像实验表明本发明细胞自噬监测探针对MCF‑7及Hela细胞等渗透性都较好,并能对溶酶体极性的变化适于细胞内定位于溶酶体及检测溶酶体极性的变化情况。本发明细胞自噬监测探针可以通过即时检测溶酶体内极性的变化来监测细胞的自噬过程。
[硕士论文] 郭蒙蒙
生物学;微生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)是从早期囊胚中的内细胞团(Inner cell mass,ICM)细胞分离而得到的。在适宜的体外培养个条件下,能够无限制的进行自我复制式的增值即自我更新,通过合适的诱导条件还能够分化成来源于内、中、外三个胚层的各种类型细胞的能力,即多项分化的潜能[1-3]。由于小鼠胚胎干细胞具有的这些特性,使其成为研究发育生物学的理想原材料和疾病模型构建的重要材料。因此,具有重大的经济和社会价值。早期分离得到的小鼠胚胎干细胞需要培养在灭活的饲养层细胞(Mouse embryonicfibroblasts,MEFs)上,并添加含胎牛血清的培养基[1]。对于胚胎干细胞的研究,其中一个重要的内容就是在体外培养的条件下如何去维持其处在多能性的状态。经过大量研究人员的不断探索目前已经建立起了LIF/血清(FBS)培养体系,无血清的N2B27培养体系以及2i[3]培养体系等适合不同胚胎干细胞的体外培养体系。研究胚胎干细胞在体外培养的条件下如何能够维持在自我更新的状态而不分化,就要对其维持自我更新的分子机制进行研究。经过研究人员的不懈努力,已经筛选和鉴定出了一些维持小鼠胚胎干细胞自我更新的关键调节基因[4]如:Tfcp2l1,Nanog, Esrrb,Sox2等,信号通路如:LIF/STAT3,WNT/β-catenin等。虽然这些信号通路和基因已经筛选出来,但是胚胎干细胞的调节是各种基因和信号通路相互作用的复杂过程。目前对于胚胎干细胞如何维持自我更新而不出现分化的分子机制仍然不清楚。因此,需要将细胞学和生物化学以及分子生物学相结合,进一步对胚胎干细胞进行研究,探究其自我更新和分化的调节机制[5]。
  前期已经有文献报道,Id基因家族的成员在无血清的N2B27培养条件下是BMP4/SMAD信号通路的下游基因,过表达后可以部分的代替BMP4的作用来维持小鼠胚胎干细胞的干性[6]。但是,Id基因家族维持mESCs自我更新的机制仍然不清楚。先前有文献报道Id1基因在含血清的培养基中能够部分的代替LIF的作用,通过上调Nanog基因的表达来维持mESCs的自我更新,同时对于中胚层的标志基因T的表达也具有一定的抑制作用[7]。但是,对于Id基因家族的另外两个成员Id2,Id3在mESCs中所发挥的作用并没有报道。因此,本课题主要研究Id2和Id3在mESCs的作用。Id家族表达的蛋白具有螺旋-环,螺旋(helix-loop-helix,HLH)结构域,对于细胞的迁移与周期发生具有促进的作用,同时又能够抑制多种前体的分化,延缓细胞的衰老[8]。因此,其对于胚胎干细胞干性的维持可能具有一定的作用。
  为了研究Id2和Id3这两个基因在mESCs中的作用,我们首先过表达这两个基因,利用相关的生物学软件设计引物并大量扩增所需要的基因片段。验证结果正确后,借助脂质体的特性将重组质粒转染到mESCs中。经过筛选与验证,确定正确的能够稳定遗传的过表达细胞系。我们将建立的过表达细胞系培养在不含有LIF的血清培养体系中进行培养。一段时间后发现过表达的细胞株仍然具有胚胎干细胞的形态,而对照组细胞出现死亡或者已经分化。接着我们对胚胎干细胞的标志性基因(如:Nanog、Oct4、Esrrb、Tfcp2l1等)进行验证。结果显示:过表达Id2或者Id3的细胞系Nanog和Oct4的免疫荧光呈阳性,且多能性的标志碱性磷酸酶染色(AP)也成阳性,而对照组均为阴性。通过对检测结果的分析,过表达后的细胞仍然维持在多能性的状态,而且Id2过表达的细胞与Id3过表达的细胞相比,产生更多的AP阳性克隆,说明其促进自我更新的作用优于Id3。因此,我们后续主要对Id2基因进行研究。接着我们通过shRNA的方法下调Id2基因的表达。结果显示:下调后的细胞出现了分化,不能维持胚胎干细胞的形态,说明Id2对mESCs干性的维持是非常重要的。随后,我们使用转录组测序技术筛选Id2调控的下游靶基因。测序结果显示:实验组和对照组进行比较,有许多基因的表达量发生了变化。通过进一步的筛选,我们发现与胚胎干细胞多能性维持具有相关作用的c-Myc和n-Myc这两个转录因子的表达上调。接着我们通过在转录水平和翻译水平对测序结果进行验证,结果与测序一致。最后,我们对经过分析后所选择的靶基因进行功能性验证。在过表达Id2的细胞系中,下调c-Myc和n-Myc的表达,结果显示:下调后胚胎干细胞出现了分化。在下调Id2表达的细胞系中,分别过表达c-Myc和n-Myc,结果显示:过表达c-Myc和n-Myc后能够对下调Id2后导致的细胞分化具有一定的削弱作用。
  综上所述,我们的研究结果表明,过表达Id2和Id3后的mESCs在不含LIF的血清培养条件下均能够维持在胚胎干细胞的状态。且Id2的作用强于Id3,Id2通过调节c-Myc和n-Myc的表达发挥促进mESCs自我更新的作用。本研究结果进一步揭示了维持胚胎干细胞干性的调控网络和分子机制,有利于以后对干细胞的基础研究和应用。
[硕士论文] 郭蒙蒙
材料工程 安徽大学 2017(学位年度)
摘要:近年来,荧光化学探针由于其具有简单方便、灵敏度高、选择性好、实时检测以及良好的生物相容性等优点,被认为是痕量检测生物体内物种如阴阳离子、小分子信号分子以及蛋白质等最有前途的方法之一。荧光探针是通过观察和检测目标样品溶液颜色或者荧光信号的变化来实现对特定样品的定性或定量分析,愈来愈多地被应用于环境检测、生命医学以及材料科学等领域。单光子荧光探针,由于激发波长较短,穿透深度较浅,很难被应用于实现在组织或者活体内跟踪检测目标离子或分子。最近,双光子显微成像(TPM)已经成为一种领先而又成熟的科学技术。在生物研究中,它具有单光子显微成像(OPM)所不具备的很多优点,如近红外激发,更优异的空间定位效果,更深的穿透深度以及更低的光漂白和光致毒性等,成为在生物医学研究中举足轻重的成像技术。此外,比率型的荧光探针,通过测量两种不同发射波长的荧光强度的比值来消除环境因素如浓度、光漂白和背景干扰(pH值、粘度、极性、温度等等)的影响以实现定量检测。具有更加理想的光学信号的双光子荧光探针的开发与应用,已经引起了科研工作者的关注,成为重要的研究领域和方向。
  焦磷酸根(PPi)是生物体中一种很重要的阴离子,它参与了许多细胞内的生化反应过程,如细胞内ATP水解、DNA和RNA的聚合反应以及其它许多生命代谢过程。此外,PPi的浓度水平还与许多疾病有很大的关系。当PPi水平异常会引起血管钙化,会导致严重的健康问题。而且,医学研究表明患有脱水焦磷酸钙沉积症(CPPD)晶化和软骨钙化的患者体内滑液中有较高浓度的PPi。因此,监测生物体内的PPi是具有重要的意义的。甲醛(FA)是一种常见的致癌和致畸物质,已经被世界卫生组织确定为潜在的变态反应源。作为一种化学污染物,甲醛造成的室内空气、大气环境和食品污染会导致甲醛中毒,造成头晕、头痛或恶心、呕吐,严重的会引起记忆力减退,甚至死亡。在大多数生物有机体中,一些氨基酸和外源性物质,在脱甲基化酶或氧化酶的催化作用下,发生新陈代谢,也会产生内源性的甲醛。在大脑组织内,正常浓度的甲醛通过DNA脱甲基过程,在长期记忆的存储、保存和检索上有着至关重要的作用。然而,人体内的甲醛含量超过一定剂量时,会引起许多疾病,包括阿尔茨海默病、神经源性炎症、过敏性肺炎、哮喘症状,心血管疾病和癌症等。因此,开发一种有效的监测生物体系中甲醛的荧光探针也是一个非常有意义的课题。
  本文在查阅大量参考文献和深入研究本课题组工作的基础上,分别基于香豆素和喹啉荧光团设计并合成了选择性识别与检测PPi和FA的双光子荧光探针PC和MQAP,并通过核磁氢谱(1HNMR)、核磁碳谱(13C NMR)以及质谱等方法对所得目标化合物进行了结构表征。还进一步研究了它们的光学性质,识别机理和在生物体系中活体成像应用等。
  一、合成并深入探究了一种基于香豆素母体的用于检测焦磷酸根的具有“ON-OFF-ON”荧光信号的双光子荧光探针PC,通过向香豆素母体框架引入对甲氧基苯乙炔,增加了香豆素母体的共轭结构,从而增加了其有效双光子共轭面积和吸收截面。探针PC的香豆素母体的羧基和二胺甲基吡啶结合后的识别基团,能实现对Cu2+的选择性识别,并形成“ON-OFF”型的荧光淬灭的检测信号。在PCCu配合物溶液中,加入焦磷酸根PPi后,体系的荧光随着PPi浓度增大恢复到之前的荧光强度,形成“OFF-ON”型的荧光检测信号。探针在PCR过程中也得到了成功地应用。由于其细胞毒性小而且细胞通透性良好,可以应用于细胞成像,也第一次应用于PPi的组织成像和斑马鱼活体成像实验。
  二、设计并合成了一个以喹啉为母体的基于2-aza-cope重排的检测甲醛分子的比率型双光子荧光探针MQAP。我们同样在喹啉母体框架六位上接一个对甲氧基苯乙炔,从而极大地拓展了喹啉的共轭结构,增大了荧光基团的双光子吸收截面。在喹啉母体的醛基位置直接引入烯丙氨基(homoallylamino)作为甲醛的选择性反应基团。探针MQAP的烯丙氨基与甲醛反应形成亚胺中间体,进一步发生2-aza-cope重排和水解,最后生成强吸电子能力的醛基。在醛基和甲氧基的推电子的共同作用下,促进了探针分子的分子内电荷转移(ICT)过程,从而探针的发射荧光光谱表现了红移现象(85nm)。紫外吸收,荧光光谱,理论计算以及高效液相色谱和质谱分析等方法验证了这一机理。探针MQAP的低毒性和较好的生物相容性,可成功应用于在活细胞和斑马鱼活体内的双光子成像。
[专利] 发明专利 CN201410302027.6
安徽大学 2014-10-29
摘要:本发明公开了一种七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料,其结构通式为:其中R为CH3O-或(CH3)2N-。本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构,具有大的双光子吸收截面,可以被双光子激发产生荧光,具有低的细胞毒性,可以进入细胞,用于细胞生物成像。
[专利] 发明专利 CN201410302036.5
安徽大学 2014-09-24
摘要:本发明公开了一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料,其结构通式为:其中R为CH3O-或(CH3)2N-。本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构,具有有效的双光子吸收截面,可以被双光子激发产生荧光,具有低的细胞毒性,可以进入细胞,用于细胞生物成像。
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