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摘要:目的 研究BALB/c致敏小鼠外周血中嗜碱性粒细胞表面分子CD63表达情况,构建小鼠嗜碱性粒细胞激活试验(BAT)模型以评价小分子药物(LMWC)致敏性.方法 以流式细胞术(CD45 APClow/IgE FITChigh)和瑞氏-姬姆萨染色血涂片检测对照组和卵清蛋白(OVA)致敏小鼠(OVA致敏组)嗜碱性粒细胞的形态和数量;以CD45 APClow/IgE FITChigh作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的流式方案,anti-IgE为阳性对照体外与小鼠嗜碱性粒细胞孵育,观察CD63的表达,建立小鼠BAT模型;以青霉素G和BSA的耦联物(PG/BSA)致敏小鼠(PG/BSA致敏组),青霉素G和OVA的耦联物(PG/OVA)体外激发,验证模型的有效性.结果 与对照组小鼠相比,OVA致敏组小鼠嗜碱性粒细胞的形态和数量差异无统计学意义(P=0.655,P=0.667);anti-IgE体外可刺激小鼠嗜碱性粒细胞表面CD63的表达;OVA致敏组小鼠外周血体外与OVA孵育后,CD63表达高于对照组[(59.70±37.93)%vs(2.15±1.13)%〗,差异有统计学意义(P=0.016);PG/BSA致敏组小鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,CD63表达高于对照组[(62.74±41.05)%vs(2.73±1.40)%],差异有统计学意义(P=0.019).结论 特定致敏原体外可引起已致敏小鼠的CD63表达上升,表明成功构建了小鼠BAT模型,并以PG验证了此模型的有效性,其可用于评价LMWC的致敏性....
摘要:目的 利用报告抗原腘窝淋巴结试验(reporter antigen popliteal lymph node assay,RA-PLNA)评价注射用双黄连(Shuanghuanglian for injection,SHLI)的致敏性,并探讨其发生机制.方法 SPF级7~8周雌性BALB/c小鼠,按体重随机分为生理盐水空白对照组(Veh)、D-盐酸青霉胺阳性对照组(D-pen,1 mg/只)、SHLI高剂量组(H,5 mg/只)和低剂量组(L,1 mg/只),共4组,6只/组.将受试物分别与TNP-OVA(10 μg/只)混合,右侧足趾部皮下注射给予小鼠,终体积50 μL/只.药后7天处死动物,摘取两侧腘窝淋巴结(popliteal lymph node,PLN),称重,计算重量指数(weight index,WI);制备单细胞悬液,计算细胞指数(cells index,CI),比较各组的RA-PLNA反应.ELISPOT检测PLN中的TNP特异性抗体分泌细胞(AFC)的数量和类型,流式细胞术检测PLN中淋巴细胞和巨噬细胞数量.与TNP-Ficoll混合时,另取小鼠,方法同上.结果 分别与两种报告抗原一起注射后,高剂量的SHLI诱导明显的RA-PLNA阳性反应(组平均WI≥2或CI≥5);ELISPOT检测发现,仅高剂量SHLI和TNP-OVA一起注射明显增加TNP特异性AFC的数量,且分泌各类抗体的AFC均明显升高(P <0.05或P<0.01);流式细胞术检测发现高剂量SHLI与TNP-OVA一起可升高PLN中巨噬细胞的数量(P<0.05).结论 在BALB/c小鼠体内SHLI不会形成新的抗原表位,也不会活化特异性T细胞,提示SHLI本身可能不具有致敏潜能....
摘要:目的 观察阳性药物D-盐酸青霉胺(D-pen)和链脲佐菌素(STZ)诱发的人免疫系统重建NPG(hu-NPG)小鼠的直接腘窝淋巴结试验(d-PLNA)反应,并比较其与NPG和BALB/c小鼠反应的异同,探索可提高药物超敏反应预测价值的模型动物.方法 雌性NPG小鼠,1.8 Gy的X线辐照后,植入人脐血造血干细胞,制备hu-NPG小鼠,取外周血,进行淋巴细胞表型分析及淋巴细胞增殖实验.hu-NPG,NPG和BALB/c小鼠各10只,每种小鼠随机分成D-pen和STZ组,每组5只.各组分别在右后肢足趾部Sc给予D-pen每只1 mg或STZ 0.75 mg,左后肢不做处理作为对照.注射后7d处死小鼠,取左、右侧腘窝淋巴结称重,计算质量指数;将淋巴结制成单细胞悬液,计算细胞指数,并对部分淋巴结进行组织病理学检查,以比较d-PLNA反应.结果 注射阳性药物D-pen和STZ后,各组小鼠一般状态良好,均未见全身毒性,且至处死时局部炎性刺激症状消失.D-pen和STZ均能诱导BALB/c小鼠出现典型的d-PLNA阳性反应,表现为注射侧淋巴结质量和细胞数量比对照侧增加,平均质量指数≥2或平均细胞指数≥5.而NPG小鼠和hu-NPG小鼠均未出现阳性反应.病理学检查发现,NPG和hu-NPG小鼠的腘窝淋巴结体积明显小于BALB/c小鼠,发育不完善.淋巴细胞表型分析发现,NPG小鼠仅有少量淋巴细胞,而hu-NPG小鼠外周血中人源性淋巴细胞以CD45+CD19+的B细胞为主,CD45+CD3+T细胞较少,且丝裂原不能刺激NPG和hu-NPG小鼠体内的人源或鼠源性淋巴细胞增殖.结论 D-pen和STZ所致的小鼠d-PLNA阳性反应依赖于体内正常的淋巴细胞数量及功能.NPG小鼠缺乏正常淋巴细胞,d-PLNA反应阴性.hu-NPG小鼠体内的人淋巴细胞功能不全,也不能诱发阳性反应.因此,hu-NPG小鼠尚不能成为d-PLNA的敏感动物....
[硕士论文] 郭岩乳
药学 山东大学 2018(学位年度)
摘要:药物引起的Ⅰ型超敏反应是药物刺激机体产生的特异性IgE介导的过度免疫应答,其主要的临床表现有皮炎、荨麻疹、哮喘、血管神经性水肿、胃肠变态反应、过敏性休克等症状,严重时可导致迅速死亡,又称为速发型超敏反应(Immediate hypersensitivity reactions,IHRs)。新药的研发必须经过临床前安全性的评价,而药物诱导IHRs的潜能(药物过敏性预测)是新药临床前安全性评估的必需环节。由于缺乏理想的临床前实验模型,目前尚不能有效的准确预测药物的致敏性,特别是预测小分子药物(Low molecule weight compounds,LMWC)的致敏性更是一个世界性难题,迫切需要建立一个更加有效的LMWC致敏性评价模型。
  正常外周血中含量最少的白细胞通常是嗜碱性粒细胞,但却是除肥大细胞IHRs最重要的效应细胞。目前临床上,自体外嗜碱性粒细胞激活试验(Basophil activation test,BAT)被开发及研究以来,其已广泛应用于研究和确诊过敏疾病(包括食物、毒液、花粉和药物等引起的过敏)。它的基本原理是在体外模拟IHRs活化嗜碱性粒细胞后,利用流式细胞术检测细胞表面活化标记物的变化,进而诊断和研究过敏疾病。与其它诊断方法比较,BAT仅需要少量外周血样品,且系体外与致敏原孵育激发,具有安全性高、耗时短、特异灵敏、技术成熟、操作简单等优点。但BAT在动物身上研究较少,所以其在药物非临床评价中的研究和应用任有待开发研究。借鉴临床上BAT的方法,探讨建立致敏动物外周血BAT模型,有望形成一种能和临床前长期毒性试验相结合的药物致敏性评价新技术,改善我国预测LMWC致敏性评价的水平。
  BALB/c小鼠高表达IgE,已被广泛用于各种药物过敏反应的动物模型构建,是研究TH2型免疫反应的主要小鼠品系。同时考虑到,大鼠是药物临床前安全性评价中长期毒性试验研究最常用的动物,而BN大鼠同样也是免疫球蛋白(尤其是IgE)高应答品系,可作为研究IHRs的主要模型动物。本课题拟首先建立BALB/c小鼠和BN大鼠BAT模型,然后选择临床上常发生IHRs的青霉素G(Penicillin G,PG)为工具药,模拟LMWC体内致敏和激发形成IHRs的半抗原假说机制。把半抗原PG和大分子蛋白质载体体外藕联形成全抗原。然后以PG和BSA的藕联物(Penicillin G conjugated BSA,PG/BSA)致敏BALB/c小鼠和BN大鼠。取致敏动物外周血,体外与PG和OVA的藕联物(Penicillin G conjugated Ovalbumin,PG/OVA)共孵育,流式细胞术观察嗜碱性粒细胞活化标记物CD63分子的表达情况,以期验证BAT模型预测LMWC致敏性的有效性。
  实验第一部分:首先建立基于流式细胞术(CD45APClow/IgE FITChigh)鉴定BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的方法。同时,利用传统瑞氏-姬姆萨染色法染色小鼠血涂片,显微镜下观察小鼠嗜碱性粒细胞的形态,并计数其相对数量。比较对照组和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏BALB/c小鼠嗜碱性粒细胞的形态及数量变化。比较流式细胞术与传统血涂片计数二者之间的差异和计算二者的相关性。选择以CD45APClow/IgE FITChigh作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的流式方案,研究anti-IgE(阳性对照)体外与小鼠嗜碱性粒细胞孵育后CD63的表达情况,确定小鼠嗜碱性粒细胞活化标记物,并优化体外孵育时间。OVA致敏BALB/c小鼠外周血,体外以OVA激发致敏的小鼠嗜碱性粒细胞后,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞CD63表达情况,以建立小鼠BAT模型。同时,以传统的被动皮肤致敏试验(Passive cutaneous anaphylaxis,PCA)证实小鼠处于致敏状态。为了验证小鼠BAT预测LMWC致敏的准确性,选择临床上可导致IHRs的典型药物PG为工具药,首先以PG/BSA致敏BALB/c小鼠,然后取致敏小鼠外周血,体外与PG/OVA共孵育,以激发小鼠嗜碱性粒细胞,观察CD63分子的表达情况,验证小鼠BAT模型检测LMWC的有效性。结果显示:(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组小鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.59±0.14%和0.54±.018%,但二者未见明显差异(P>0.05)。小鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组嗜碱性粒细胞形态未见明显改变;嗜碱性粒细胞数量分别为0.60±0.42%和0.70±0.27%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.51,说明以CD45APClow/IgE FITChigh可以作为鉴定小鼠嗜碱性粒细胞的标记物。(2)Anti-IgE体外可刺激小鼠嗜碱性粒细胞表面CD63的表达,体外最佳孵育时间为15min,提示CD63可作为建立小鼠BAT模型的激活标记物。(3)OVA致敏小鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为59.70±37.93%,显著高于PBS体外刺激(2.15±1.13%P<0.05)。(4)PG/BSA致敏小鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为62.74±41.05%显著高于PBS对照组(2.73±1.40%P<0.05)。表明成功建立了小鼠BAT并且此可以用于检测LMWC的致敏性。
  第二部分:首先建立流式细胞术(CD45APClow/IgE FITChigh)鉴定BN大鼠嗜碱性粒细胞数量的方法,确定大鼠外周血中嗜碱性粒细胞群。同时利用瑞氏-姬姆萨法染色血涂片,显微镜下观察大鼠嗜碱性细胞的形态,并计数嗜碱性粒细胞的相对数量。比较对照组和OVA致敏的BN大鼠的嗜碱性粒细胞形态及数量变化。比较两种计数方法的相关性。由于大多数白细胞分化抗原在生物进化中具有保守性和在过敏性休克的大鼠模型中嗜碱性粒细胞表面CD63表达上升,所以建立BN大鼠BAT的体外孵育时间参考小鼠为15min来检测CD63的表达情况。取肝素完全抗凝OVA致敏大鼠外周血,与OVA在37℃孵育15min,流式细胞术检测嗜碱性粒细胞表面分子CD63的表达情况,PCA验证BAT中的大鼠是致敏状态。为了检测BAT预测LMWC药物致敏的准确性,以PG/BSA致敏大鼠PG/OVA体外激发,观察CD63分子的表达情况。(1)流式细胞术计数显示,对照组和致敏组大鼠嗜碱性细胞的数量分别是0.25±0.07%和0.24±0.10%,二者未见明显差异(P>0.05)。大鼠血涂片形态观察显示,对照组与致敏组比较未见明显形态改变;对照组与致敏组嗜碱性粒细胞数量分别为0.3±0.24%和0.4±0.37%,二者未见统计学差异(P>0.05)。两种计数方法t检验为无显著性差异(P>0.05),相关系数R=0.61,说明CD45APClow/IgE FITChigh可以作为鉴定大鼠嗜碱性粒细胞的流式方案。(2)OVA致敏大鼠的外周血体外与OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为35.00±23.90%,显著高于PBS体外刺激(1.78±1.08%P<0.05)。(3)PG/BSA致敏大鼠的外周血体外与PG/OVA孵育后,嗜碱性粒细胞表面CD63表达为31.10±20.04%显著高于PBS对照组(2.74±2.10%P<0.05)。BN大鼠建立的BAT可以用于检测LMWC的致敏性。
  综上所述:经致敏后的小鼠和大鼠嗜碱性粒细胞,当体外再次接触相同抗原时,流式细胞术可明显检测到嗜碱性粒细胞表面激活标记物CD63表达,表明小鼠和大鼠BAT模型构建成功。利用该模型可有效检测PG的致敏潜能,提示该模型可用于评价LMWC的致敏性。
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