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[硕士论文] 郑福存
化学 东华理工大学 2017(学位年度)
摘要:目前,国内外对壳聚糖酶的研究主要集中在产壳聚糖酶菌株的筛选、酶的分离纯化及产酶条件优化等方面。由于大多微生物产生的壳聚糖酶活性较低,产量高,很难实现工业化的生产。随着分子生物学技术的不断发展,壳聚糖酶基因的克隆表达、重组、突变等技术在酶工程领域得到了广泛的应用。主要包括酶基因的定点突变,化学修饰改进酶的特性,提高酶活力和表达量等方面。运用基因工程技术克隆壳聚糖酶基因,分析酶的结构,构建产壳聚糖酶的重组微生物,是获得比自然酶活力更高、更稳定的工业酶的有效途径之一。
  本实验以枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板,成功克隆出一条壳聚糖酶基因。该基因序列大小831bp,编码277个氨基酸,理论分子量为31.3kDa,理论等电点为9.51。将该壳聚糖酶基因的DNA片段构建到热激表达载体pHsh中,得到含有壳聚糖酶基因的重组表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌细胞中,通过菌落PCR和测序鉴定,证实了转化的成功,得到了表达壳聚糖酶的重组大肠杆菌。
  对重组壳聚糖酶的酶学性质进行了研究,得出结论:壳聚糖酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0。对壳聚糖酶的热稳定性研究结果表明,当温度为35℃时,相对酶活性为100%,当温度升高到50℃时,其相对酶活性下降了50%,表明该酶具有一定的热稳定性。对诱导后的宿主菌细胞进行有效破碎,使用镍柱对重组壳聚糖酶蛋白进行纯化,SDS-PAGE电泳检测结果表明,得到了分子量大小约为28kDa的蛋白质。根据米氏方程计算出Km值为2.952mg/mL,Vmax值为0.111mg/mL。
  运用PYMO对壳聚糖酶进行了同源建模分析,总体分子结构显示:该酶含有14个α螺旋和5个β链,组成了两个球状上部和下部结构域,产生用于底物结合的活性位点裂缝。该酶的分子折叠方式类似于来自链霉菌属的脱乙酰壳多糖酶。运用Biolog自动鉴定系统,对重组大肠杆菌对碳源、氮源的利用研究。结果表明;以四唑紫为还原染色剂,能够利用D-果糖等26种碳源,同时能够利用4种氮源,对8种抗生素有敏感作用。
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