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[博士论文] 赵龙
生物化学与分子生物学 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院 2015(学位年度)
摘要:肝细胞核因子1α(HNF1α)作为肝脏中最重要的转录因子之一,以复合体形式参与调控多种肝脏特异基因的表达,并涉及蛋白质合成、物质代谢、损伤修复等多个生物学过程。同时HNF1α也是维持胰腺功能的重要分子,调控胰岛素、葡萄糖转运蛋白等分子的表达。在肠和肾中,HNF1α也发挥着调控发育和物质吸收的重要作用。在糖代谢中,HNF1α更是扮演着“中心分子”的作用。HNF1α的突变会引发Ⅲ型青少年发病的成人糖尿病,也就是临床上所说的MODY3,这是一种由单基因突变所导致的负显性突变疾病,临床上表现为25岁前发病,胰岛素分泌不足,血糖严重升高等症状,由于患者HNF1α基因突变的晚期糖尿病并发症的频率高,早期诊断与适当的治疗可以减少或延缓糖尿病并发症的发生。因此研究HNF1α调控机制和功能有着重要的意义。
  在研究中我们通过IP-MS发现,HNF1α是一个磷酸化蛋白质。并且我们还发现了一个新的磷酸化位点,Ser249位。接下来我们通过体外磷酸化实验发现,无论内源或者外源ATM蛋白激酶都可以磷酸化HNF1α的Ser249位点。当辐射处理引发DNA损伤活化ATM激酶活性时,HNF1α的磷酸化水平显著提高。我们发现使用ATM特异抑制剂KU55933处理细胞后,HNF1α磷酸化水平下降。IP-MS检测结果也显示抑制剂处理组249位磷酸化消失。为了进一步研究Ser249位点突变对HNF1α功能和调控机制的影响,我们构建了HNF1α-S249A突变体,通过荧光素酶报告基因实验和real-time PCR实验结果发现,与野生型相比,HNF1α-S249A突变体转录活性和下游靶基因表达均显著下调。实验中我们还发现,HNF1αSer249位点的磷酸化与之前已报道的Ser247位点的磷酸化相互独立互不影响,竞争抑制实验显示,HNF1α-S249A突变体不具有负显性抑制功能。我们通过EMSA和CHIP实验分别从体内和体外两条途径证明,与野生型HNF1α相比,HNF1α-S249A突变体的DNA结合能力显著下调,间接荧光免疫实验证明,HNF1αSer249位点突变不影响HNF1α的亚细胞定位。同时我们也在体内实验中发现,HNF1α-S249A突变体会引起糖代谢功能异常,提示了ATM调控糖代谢过程中新的机制发现。我们不仅从分子水平探索了HNF1α磷酸化修饰的分子机制和生物学意义,而且通过HNF1α-WT和HNF1α-S249A转基因小鼠实验来研究HNF1α对于生理功能的意义。我们以转基因野生型HNF1α作为对照研究发现,HNF1α-S249A转基因小鼠并未表现出明显的糖尿病或者其他糖代谢异常表型,体重变化、葡萄糖耐受、胰岛素耐受都未出现异常,而丙酮酸耐受下降,说明,HNF1αSer249位点突变降低了HNF1α-S249A转基因小鼠糖异生能力,此外,我们还对转基因小鼠血清肿瘤标志物进行检测,转基因HNF1α-WT小鼠在胰腺肿瘤标志物CA242、肝癌肿瘤标志物AFP、乳腺癌肿瘤标志物CA153显著下调,这些数据也许提示了HNF1α在肿瘤发生中的一些作用。
  除了磷酸化修饰之外,我们还通过IP-MS鉴定到了HNF1α的乙酰化位点Lys117位。且临床上有报道在MODY3患者中检测到117位突变,我们推测该位点的乙酰化修饰对HNF1α的功能十分重要。首先我们通过Lys乙酰化抗体免疫印迹发现,HNF1α是一个乙酰化蛋白,共转染乙酰化酶p300和使用去乙酰酶抑制剂TSA/Nam可以促进HNF1α乙酰化,而饥饿和乙酰化酶p300抑制剂处理会降低HNF1α乙酰化水平。同时,为了进一步研究HNF1αLys117位点乙酰化对HNF1α的功能和调控机制影响,我们构建了Lys117位的点突变,通过荧光素酶报告基因实验和real-time PCR实验显示,Lys117位点突变下调了HNF1α的转录活性。竞争抑制实验显示,HNF1α-Lys117位点突变体不具有负显性抑制功能。接下来,我们通过EMSA和CHIP实验分别从体内和体外两条途径证明,与野生型HNF1α相比,HNF1αLys117位突变体的DNA结合能力显著下调,间接荧光免疫实验证明,HNF1αLys117位点突变不影响HNF1α的亚细胞定位。同时我们也在体内实验中发现,HNF1αLys117位点突变会引起糖代谢功能异常。我们通过免疫共沉淀相互作用和荧光共振(FRET)实验以及生物信息学分子模建发现,HNF1αLys117位点突变或者p300抑制剂处理会减弱其二聚体稳定性,从而降低了HNF1α的DNA结合能力,下调了HNF1α的转录活性和下游靶基因表达。
  纵观整个研究过程,我们的研究第一次发现了HNF1α的一个新的磷酸化位点和调控它的上游激酶ATM,为ATM激酶参与调控糖代谢的靶分子提供了新的思路,也为ATM作为HNF1α的共激活子在临床上作为治疗糖代谢异常的新的途径提供了一些可能。同时我们首先发现的HNF1α的一个新的赖氨酸乙酰化位点,证明了这个位点受到乙酰化酶p300的调控,并且发现这个位点的乙酰化对于维持HNF1α二聚体结构稳定性有着重要作用。希望通过我们的以上研究可以找到HNF1α翻译后修饰调控转录的新机制,为HNF1α突变引发疾病的筛查、早期诊断以及使用抑制剂作为治疗手段提供新的思路。
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