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[硕士论文] 赵荣娟
生物学;微生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin,TA)系统丰富存在于大部分的细菌和古菌的染色体以及噬菌体的基因组中。TA系统具有很多的作用,例如为适应各种胁迫反应而诱导细胞休眠、抑制噬菌体、调节基因表达和耐受抗生素等。Ⅱ型毒素-抗毒素系统由于其在细菌基因组中的丰度而在五种类型中被研究得最为充分和深入。Ⅱ型TA系统作用方式为两个基因都被翻译成蛋白质,抗毒素通过蛋白质-蛋白质相互作用抑制毒素的毒性。抗毒素蛋白分成C端和N端这两个结构域。抗毒素的C端是与毒素结合结构域,中和毒素的毒性;N端为与启动子DNA结合的结构域,参与负反馈调节抑制TA系统的基因转录。目前对于抗毒素参与负反馈调节细节的研究还很少,需要进一步对其结构基础进行研究,揭示其结构功能关系,从而阐明其作用机制。
  本课题的研究对象为SO_1444/SO_1445毒素-抗毒素系统是南海所王晓雪课题组发现的一对Ⅱ型毒素-抗毒素系统。他们的研究结果表明抗毒素SO_1445可以与自身启动子上特定的回文序列结合,且在有些菌株中只有SO_1445单独存在。本课题试图通过对SO_1444/SO_1445系统中抗毒素SO_1445与启动子DNA的相互作用及其复合物结构的研究揭示其功能机制。
  通过序列比对和二级结构预测确定了SO_1445上与启动子DNA结合的N端结构域区段(由58个残基组成,命名为SO_1445-N-58),把它与全长SO_1445分别进行基因重组克隆、异源表达和蛋白纯化。利用ITC检测全长SO_1445以及其N端结构域(SO_1445-N-58)与启动子DNA特定的回文序列(19bpdsDNA)之间的相互作用,尝试用NMR和X-射线晶体学方法解析SO_1445和SO_1445-N-58的结构及其分别与启动子DNA形成的复合物的结构。ITC结果显示SO_1445与19bp dsDNA有相互作用且结合比例为4∶1,但SO_1445-N-58与19bp dsDNA的相互作用不显著。而NMR、DLS、CD和SEC检测的结果表明全长蛋白和N端区段与核酸均有相互作用。NMR数据显示SO_1445和SO_1445-N-58的结构及其分别与19bp dsDNA结合的复合物结构不适于用NMR解析。SO_1445-N-58可在特定条件下生成晶体,晶体结构与其他抗毒素的结构很相似。SO_1445-N-58和SO_1445与19bp dsDNA的复合物的结晶条件仍在进行中。我们的结果表明SO_1445的C端区段的结构相对无序,它对N端区段与DNA的结合有促进作用,且在N端区段与DNA结合之后从无序转变成螺旋结构。这些结果有助于我们更好地理解抗毒素的N端和C端区段在其功能中的协同作用。
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