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摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
摘要:试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果.首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞.实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、inte grinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组.睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
摘要:为探究lncRNA在鸡生殖细胞中的调控作用,以如皋黄鸡受精蛋为试验材料,基于高通量测序筛选结果,利用RACE技术获取lncRNA-CEPT8序列全长,通过荧光定量检测和核质分离试验确定lncRNA-CEPT8的富集位置,并进行ORF开放阅读框预测及构建原核融合表达载体,提取蛋白质后利用Western blot技术检测lncRNA-CEPT8编码的小肽.结果 表明:lncRNA-CEPT8全长为1 248 bp,在鸡原始生殖细胞质中富集,具有大小为246 bp且编码81个氨基酸的ORF,Western blot检测结果表明lncRNA-CEPT8编码一条大小约为9 ku的小肽.这一研究为进一步探究lncRNA-CEPT8编码的小肽在鸡原始生殖细胞中的调控作用及其对生殖细胞的影响奠定了基础....
摘要:本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SSC 诱导分化体系提供新的依据。以RNA-Seq 技术对鸡ESC、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和SSC进行测序分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的候选lncRNAs,以qRT-PCR 对候选lncRNAs在三种细胞中表达趋势变化进行验证,通过BLAST 和RNAplex 软件对候选lncRNAs 进行靶基因预测,同时以DAVID 数据库、WEGO 以及STRING 等在线软件进行功能和蛋白网络互作分析。
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