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摘要:本研究旨在检测CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的组织表达特异性,克隆其编码区并构建重组载体转染DF-1 (D fibroblast-1,DF-1)细胞并制备多克隆抗体,为初步研究鸡(Gallus gallus) CREPT基因参与调控细胞周期的生物学功能提供理论依据.以鸡生殖嵴cDNA为模板扩增CREPT基因CDS区,并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析.将该基因与pcDNA3.1和pEGFP-N1载体相连获得重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT之后,转染鸡DF-1细胞,并采用基因免疫法制备CREPT基因多克隆抗体并检测效价,利用qRT-PCR检测过表达CREPT基因后DF-1细胞内相关基因的表达情况.生物信息学分析发现,鸡CREPT编码区序列总长978bp,编码325个氨基酸,该氨基酸序列中存在一个RPR结构域(regulation of nuclear pre-mRNA domain)和卷曲结构域;以原鸡(G.gallus)CDS序列为模板成功克隆的如皋黄鸡(G.domesticus)CREPT基因长978 bp,测序结果准确,与原鸡CDS序列一致,同源性100%;组织表达谱分析显示,CREPT在睾丸、卵巢和大脑中mRNA表达量较高(P<0.01),而在肠组织(P<0.01)、骨骼肌(P<0.05)和脾脏(P<0.05)中的mRNA表达量较低;成功构建重组表达载体pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT;转染融合表达载体pEGFP-CREPT后显示,CREPT表达于DF-1细胞质中;使用基因免疫法制备多克隆抗体血清,免疫荧光检测(immunogen fluorescent assay,IFA)检测显示,制备的多克隆抗体最佳效价为1:10,Western blot证实,pcDNA3.1-CREPT真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,qPCR检测结果表明,pcDNA3.1-CREPT载体能够在DF-1上过表达CREPT基因,并引起细胞周期调控相关基因p15RS(P 15 related gene on G 1/S progression)、转录因子4(transcription factor 4,TCF4)、细胞周期蛋白D1(cyclinDI)和β-链蛋白(b-catein)的表达变化.本研究成功克隆了鸡CREPT基因,并制备了具有特异性的多克隆抗体,该基因在DF-1细胞质中表达,CREPT基因的表达能下调pl5RS基因的表达(P<0.01),上调TCF4(P<0.05)、cyclinD1 (P<0.01)和b-catein (P<0.01)的表达,该研究结果为进一步研究鸡CREPT基因的生物学功能提供了理论依据....
摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
摘要:试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果.首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞.实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、inte grinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组.睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
[专利] 发明专利 CN201910563547.5
扬州大学 2019-09-27
摘要:本发明涉及一种通过羽色结合分子遗传标记鉴别PGC移植后代鸡的鉴定方法,属于生物技术领域。为了解决PGC移植后代的鉴别问题,本发明采用后代鸡羽色和微卫星标记分析的方法成功对后代鸡的遗传来源进行鉴别。本发明适用于禽类的种质资源的保护和物种复原,本发明可行性强,鉴定准确,成本低。能够有效鉴别后代鸡的遗传组成,为基因编辑模型鸡生产提供技术支持。
[专利] 发明专利 CN201910514421.9
扬州大学 2019-09-06
摘要:本发明涉及一种新型鸡CEF重编程为PGC的诱导体系的建立方法,属于生物技术领域。在分离的原代CEF中,慢病毒外源导入OCT4,SOX2,NANOG,LIN28重编程因子,连续培养21天后,利用SSEA‑1抗体进行iPSC细胞株鉴定,鉴定为阳性的细胞株进行更换为BMP4/BMP8b/EGF诱导体系,诱导成为iPGC。本发明解决了濒危品种鸡PGC获取的数量低的问题,实现了濒危鸡品种的种质资源保护和物种复原工作。
摘要:为探究lncRNA在鸡生殖细胞中的调控作用,以如皋黄鸡受精蛋为试验材料,基于高通量测序筛选结果,利用RACE技术获取lncRNA-CEPT8序列全长,通过荧光定量检测和核质分离试验确定lncRNA-CEPT8的富集位置,并进行ORF开放阅读框预测及构建原核融合表达载体,提取蛋白质后利用Western blot技术检测lncRNA-CEPT8编码的小肽.结果 表明:lncRNA-CEPT8全长为1 248 bp,在鸡原始生殖细胞质中富集,具有大小为246 bp且编码81个氨基酸的ORF,Western blot检测结果表明lncRNA-CEPT8编码一条大小约为9 ku的小肽.这一研究为进一步探究lncRNA-CEPT8编码的小肽在鸡原始生殖细胞中的调控作用及其对生殖细胞的影响奠定了基础....
[专利] 发明专利 CN201910165488.6
扬州大学 2019-06-04
摘要:本发明涉及一种鸡胚胎成纤维细胞单克隆细胞系建立的方法,属于生物技术领域。在注射管中塞入干净干燥的棉球,将针管式滤器的大头连接注射器的针口,将橡皮管一头连接针管式滤器的小头,另一头连接处理过后的玻璃管,用于直接挑取细胞。本发明中口吸管采用的材料均容易购买,且价格低廉。组装完成后,成品操作简单,使用者可以挑取特定单个细胞进行单克隆培养,所采用的重组口吸管适用于所有类型的细胞。
[硕士论文] 赵瑞丰
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2019(学位年度)
[专利] 实用新型 CN201820385249.2
扬州大学 2018-11-27
摘要:本实用新型涉及一种简易的用于鸡胚显微注射的断针装置,属于生物技术领域。断针装置,包括电池组(1)、控制器(2)、马达(3)、砂轮(5),电池组(1)通过控制器(2)连接马达(3),马达(3)通过导线连接电池组(1),马达(3)通过联轴器(4)驱动连接砂轮(5)。本实用新型用于鸡胚显微注射针的断针,可以简便的根据需求对显微注射针进行断针,操作简便易行,结构合理简单,使用方便,成本低廉,易于推广应用。
摘要:本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SSC 诱导分化体系提供新的依据。以RNA-Seq 技术对鸡ESC、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和SSC进行测序与分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的候选lncRNAs,以qRT-PCR 对候选lncRNAs在三种细胞中表达趋势变化进行验证,通过BLAST 和RNAplex 软件对候选lncRNAs 进行靶基因预测,同时以DAVID 数据库、WEGO 以及STRING 等在线软件进行功能和蛋白网络互作分析。
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