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[硕士论文] 赵树琪
生物学 武汉科技大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  观察褐藻多酚Eckol的抗肿瘤作用,并探讨其可能的作用机制,为Eckol在肿瘤防治中的应用提供实验依据。
  方法:
  1、Eckol的抗肿瘤作用研究:分别建立移植型S180腹水瘤及肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给予生理盐水或Eckol(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg)7天。S180腹水瘤小鼠模型造模后继续给药15天,每天记录小鼠活动状态,记录小鼠生存天数。S180肉瘤荷瘤小鼠模型造模后继续给药10天,每天记录小鼠体重,记录小鼠生长曲线,最后一次给药1h后,处死小鼠,分离脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数;剥取肉瘤组织,称重;HE染色观察肿瘤组织病理变化;TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡;以Western blot法测定瘤组织EGFR、Bcl-2、Caspase-3的表达水平。
  2、Eckol对S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能的影响:建立移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型,造模前预防性给药7天,造模后继续给药10天。取小鼠外周血血清,ELISA法检测IL-2、IL-10、TNF-α、IFN-γ、TGF-β的水平;以碳粒廓清法了解小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能;取外周血,流式细胞术测定小鼠外周血T细胞亚群分布;分离小鼠脾脏,磨碎后过滤、种板,ConA诱导脾细胞转化,MTT法检测Eckol对脾细胞转化的影响;免疫组化法测定CD11c阳性细胞在肿瘤组织中的分布,了解肿瘤组织树突状细胞浸润情况;从小鼠骨髓中获得小鼠骨髓来源的单核细胞,用含IL-4和GM-CSF20ng/ml的RPMI1640培养基培养7天,诱导分化为树突状细胞。收集细胞,流式三标法(CD11c、CD86、MHC-Ⅱ)检测髓源性树突状细胞表型。
  3、Eckol对Reg3A诱导人胰腺癌SW1990细胞过度增殖的影响:体外培养SW1990细胞,Eckol(0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)处理细胞48h,加入50ng/ml的外源性Reg3A蛋白共处理24h后,MTT法检测细胞存活率。选取Eckol(5、10、20μg/ml)三个浓度组,Eckol处理细胞48h后,50ng/ml外源性Reg3A蛋白共处理24h,流式细胞术测定细胞周期;软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Real Time PCR法检测JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA表达;Western blot法检测JAK2/p-JAK2、STAT3/p-STAT3、NF-κB、Cyclin D1蛋白水平表达。
  结果:
  1、Eckol的抗肿瘤效应:Eckol体内干预可延长移植型S180腹水瘤荷瘤小鼠生存天数;移植型S180肉瘤荷瘤小鼠模型中,Eckol呈剂量依赖性地降低肉瘤重量,升高脾指数,且不明显改变动物生存曲线。肿瘤组织HE染色结果显示,Eckol处理组中,肉瘤组织微血管减少,坏死增加,核固缩明显,癌巢周围发现单核细胞浸润。TUNEL染色结果显示,Eckol处理组肿瘤细胞凋亡增加。肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3表达上升,抑凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白EGFR表达下降。提示Eckol体内抗肿瘤效应明显。
  2、Eckol对移植型S180肉瘤荷瘤小鼠免疫功能具有显著调节作用:ELISA结果显示,Eckol处理组S180肉瘤荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ显著升高,提示Eckol能够调节Th1/Th2平衡,促进Th1介导的细胞免疫;此外,Eckol提高荷瘤小鼠外周血单核-吞噬细胞的吞噬功能,促进脾淋巴细胞转化,调节外周血T细胞亚群比例。免疫组化及流式结果显示,Eckol能够促进肿瘤组织树突状细胞的浸润,且影响树突状细胞表型,促进髓源性树突状细胞成熟。提示,Eckol体内抗肿瘤效应极可能与其对荷瘤小鼠的免疫功能的调节作用相关。
  3、Eckol对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖的抑制作用:MTT法显示,5-20μg/ml Eckol对SW1990细胞增殖没有明显的体外抑制作用,但Eckol+Reg3A与Reg3A单独作用相比,细胞存活率下降。细胞周期检测发现,与Reg3A单独作用相比,Eckol+Reg3A组S期和G2/M期细胞减少,G0/G1期细胞增多。软琼脂克隆形成实验结果显示,Eckol+Reg3A组的克隆数比Reg3A组克隆数明显减少。Real Time PCR和Western blot结果发现,Reg3A可以上调JAK2、STAT3、NF-κB、Cyclin D1mRNA及蛋白的表达水平,而Eckol可浓度依赖性地抑制这些上调作用。提示,Eckol体外对Reg3A诱导SW1990细胞过度增殖具有抑制作用,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
  结论:
  1、Eckol具有显著抗肿瘤效应,其体内抗肿瘤效应的发挥可能与其调节荷瘤小鼠免疫功能密切相关。
  2、Eckol体外可抑制胰腺炎症相关介质Reg3A蛋白诱导的胰腺癌SW1990细胞过度增殖,提示Eckol对伴随炎症的胰腺癌的恶性进展具有潜在的抑制效应,其机制可能与JAK2/STAT3和NF-κB/Cyclin D1信号通路相关。
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