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[硕士论文] 赵柯郁
生物工程 内蒙古大学 2017(学位年度)
摘要:乳脂是牛奶中重要的营养成分之一,乳脂含量是衡量牛奶质量的重要指标。乳脂合成受到多种信号通路的调节,其中雷帕霉素靶蛋白(the mechanistictarget of rapamycin,mTOR)信号通路对乳脂合成发挥着重要的调控作用。mTOR是一种丝/苏氨酸激酶,属于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作为核心组分与其他不同蛋白形成两种复合物,mTOR complex1(mTORC1)和mTOR complex2(mTORC2)。mTORC1和mTORC2在胞内发挥不同的作用,mTORC1主要在调控细胞的增殖、代谢及蛋白合成等方面发挥作用;mTORC2则参与调控细胞骨架、细胞迁移及代谢等过程。目前,关于mTORC1在乳脂合成调控方面的研究报道比较多,而mTORC2尚显不足,二者在奶牛乳腺上皮细胞中对乳脂合成的调控作用对比也鲜有报道。本实验利用实验室分离并纯化得到的奶牛乳腺上皮细胞作为研究模型,首先应用ATP竞争性mTOR抑制剂AZD8055处理细胞,同时抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特异性抑制剂rapamycin处理细胞,抑制mTORC1信号通路活性,并利用RNA干扰技术靶向沉默mTORC1核心组分raptor基因来抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心组分rictor基因来抑制mTORC2活性。利用Western blot检测各组mTORC1和mTORC2信号通路活性,同时利用ELISA检测各组细胞培养液中甘油三酯(TG)、软脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用质谱检测rapamycin处理组,rictor基因沉默组胞内各类脂肪酸的含量;最后,对比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情况下和mTORC1、mTORC2分别被抑制情况下TG、PA、DHA含量变化,对比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。
  本研究主要内容包括:⑴用AZD8055处理细胞后,MTT法检测显示100 nMAZD8055处理12h,100nMAZD8055处理24h,200nMAZD8055处理12h和200nMAZD8055处理24 h时均可抑制细胞增殖,其中200nM处理24h组效果最显著(p<0.05); Western blot结果显示,用AZD8055处理细胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p<0.05); ELISA结果显示对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和258.75±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055处理24 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml和188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055处理12 h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为14.74±2.61 mmol/L、19.54±1.53 ng/ml和183.82±26.94 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑵利用rapamycin处理抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为5.42±0.08 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和403.3±11.17 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin处理8h组细胞培养液中TG、PA和DHA含量分别为4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml和297.82±20.8 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量2844.23±282.92 mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑶靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml和527.99±32.67 pg/ml,Raptor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46ng/ml和331.84±48.02 pg/ml。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05);⑷靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,对照组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14 ng/ml和109.47±7.46 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3070.54±105.07mg/kg; Rictor基因沉默组细胞培养液中的TG、PA和DHA含量分别为2.49±0.24mmol/L、6.93±0.14 ng/ml和55.74±6.01 pg/ml,细胞内31种脂肪酸总量3028.66±120.05mg/kg。和对照组相比,处理组细胞培养液中TG、PA和DHA含量均显著降低(p<0.05),细胞内31种脂肪酸总量降低,但差异不显著(p>0.05);⑸三种方法对比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根据TG、PA和DHA抑制率分析,对TG、PA和DHA合成的作用mTORC2> mTORC1;另一方面综合考虑通路活性以及TG、PA和DHA抑制率,对TG和DHA作用 mTORC2>mTORC1,对PA作用 mTORC1>mTORC2。
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