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摘要:目的 观察血红素加氧酶1(H0-1)基因敲减对肺腺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的影响,并探讨其机制.方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测人支气管上皮细胞(HBECs)和人肺癌细胞系A549、H1299、H358和H1993中HO-1 mRNA的表达水平,免疫组织化学染色检测人肺腺癌标本组织中HO-1的表达量.采用RNA干扰技术,将HO-1短发卡RNA(shRNA)转染A549细胞,制备稳定低表达HO-1的A549细胞(HO-1 shRNA组),并行RT-qPCR和Western blot验证.应用自噬诱导剂Torin1或抑制剂Bafilomycin A1(Baf A1)处理HO-1 shRNA组A549细胞和对照组细胞,Western blot检测各组自噬标志物LC3B和p62的表达.采用计数法、Transwell实验和伤口愈合实验分别评估各组A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力.结果 肺癌细胞系A549、H1299、H358和H1993中HO-1 mRNA的表达均显著高于HBECs,人肺腺癌组织中HO-1过表达.未处理、Torin1处理和Baf A1处理情况下,HO-1 shRNA组细胞的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值和p62蛋白表达量均高于相应对照组(均P<0.05);经过11d培养后,HO-1 shRNA组细胞数分别为相应对照组的41.8%、30.4%和14.0%;HO-1 shRNA组下室细胞数分别为(35.7±2.1)、(27.0±1.0)和(38.0±1.0)个/视野,均低于相应对照组[分别为(66.0±9.2)、(39.3±1.2)和(43.0±2.6)个/视野,均P<0.05];HO-1 shRNA组的迁移距离分别为(7.47±0.91)、(4.23±0.82)和(5.42±0.24)mm,均低于相应对照组[分别为(10.07±1.26)、(7.14±0.07)和(12.04±0.80) mm,均P<0.05].结论 HO-1敲减通过阻止自噬来抑制肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移....
摘要:为了研究上皮性钙通道TRPV6(transient receptor potential vanilloid 6)对乳腺分化发育的影响,本实验首先收集了发育不同时期的小鼠乳腺样本,共11个时间点,包括青春前期、青春期、孕期、泌乳期以及退化期,通过免疫荧光染色的方法观察了TRPV6在乳腺发育过程中的表达变化.其次,利用3维培养技术、Real-time PCR技术以及免疫荧光技术探究了TRPV6对正常乳腺上皮细胞MCF10A分化的影响.结果表明,在乳腺发育的不同阶段,TRPV6的表达水平具有明显差异,且在泌乳期达到最高;敲减TRPV6可以显著抑制MCF10A乳腺微球的形成,表现在成球数量的减少和微球平均直径的下降;在RNA和蛋白水平的检测结果显示TRPV6的敲减影响多个细胞分化相关分子的表达.上述结果提示TRPV6在乳腺发育过程中可能发挥重要作用....
摘要:为研究靛玉红对ATP引起的巨噬细胞免疫反应的影响,采用中性红摄入法检测细胞吞噬功能,用MTT法检测细胞活力,通过DHE探针检测ROS的产生.结果表明:细胞外ATP可抑制巨噬细胞吞噬、导致细胞死亡并促进ROS产生,靛玉红对ATP引起的以上免疫反应有抑制作用.为了解靛玉红的作用机制,进一步研究其对ATP引起的[Ca2+]i升高和P2X7受体介导的膜通透性增加的影响.结果显示:靛玉红可降低ATP引起的[Ca2+]i升高,抑制ATP诱发的EB进入.结果提示,靛玉红对P2X7的活化有阻断作用,其对ATP引起的免疫反应的抑制效果可能是通过抑制P2X7受体实现的....
[博士论文] 赵丹
生物学;遗传学 南开大学 2016(学位年度)
摘要:乳腺癌是癌症中的一个大类,目前来看,是全球最为危害女性健康的常见癌症种类之一,其发病率位于所有女性恶性肿瘤的首位,其致死人数在所有女性癌症中仅次于肺癌,当考虑到年龄因素时,在20-60年龄段的女性中乳腺癌则是所有女性健康的最大敌人。而乳腺发育过程的异常往往与乳腺癌的发生发展密切相关。很多与乳腺癌的发生发展相关的基因在其表达出现异常时,往往会造成乳腺发育分化的异常,进而演变为自发成瘤或使其更具有易感性。可以说,研究乳腺发育对研究乳腺癌的发生发展及诊断和治疗是有显著意义的。Zincfinger homeobox3(ZFHX3)基因(又称之为AT-motif binding factor1,ATBF1)是我们实验室发现的抑癌基因,该基因在多种癌症的发生发展过程中均有所贡献。该基因所在的染色体区段在多种癌症中频繁缺失,在乳腺癌中其表达显著下降,且这种下降在临床上与各种诊断指标密切相关(如肿瘤大小、肿瘤的分子标志物、肿瘤的分级及病人的预后生存)。我们的前期研究揭示了该转录因子在乳腺细胞中与重要的激素信号,如雌激素和孕激素的相关关系。本论文则立足于探究在另一重要的激素信号催乳素(prolactin)的作用下的乳腺泌乳期分化发育过程中,ZFHX3发挥的作用。
  我们收集了不同发育时期的小鼠乳腺组织,这涵盖了小鼠出生后乳腺发育的各个阶段:青春前期、青春期、成熟期、孕期、哺乳期和退化期。基于蛋白印迹和免疫组化的分析,我们发现ZFHX3在小鼠乳腺发育不同时期的表达呈现泌乳期达到峰值的特点,其表达模式更是提示我们其在小鼠乳腺腺泡腔上皮的成熟分化过程中具有作用。这进一步促进我们研究其在乳腺泌乳期分化中的作用。
  我们首先使用了一个泌乳期分化的体外细胞模型来研究在泌乳期激素催乳素prolatin和糖皮质激素地塞米松(dexamethasone)诱导下,HC11细胞分化过程中ZFHX3的改变所引起的影响和可能的分子机制。HC11是一个能够在高密度培养且在上述激素的作用下经5天以上培养产生类似乳腺微球结构并诱导酪蛋白β-casein(乳汁蛋白的主要成分之一)表达的一个被广泛使用的体外模型。我们发现,虽然在上述激素的处理下,ZFHX3的表达和定位并未发生明显改变,其在该细胞中的表达本身呈现一个较高的水平,且一旦利用shRNA将Zfhx3的表达水平敲低,则在相应的激素诱导下,细胞分化产生乳腺微球的能力以及诱导β-casein的表达水平均受到明显抑制。这一抑制仅与细胞对催乳素的响应受抑制有关,而与对糖皮质激素地塞米松的响应无关。进一步的研究表明,Zfhx3的敲减显著影响了催乳素诱导的催乳素信号核心分子Stat5的磷酸化水平,且这一作用可能建立在Zfhx3敲减后催乳素受体Prlr的表达下调的基础上。
  进而,我们在小鼠模型上进行了相应的实验设计并探索了Zfhx3敲除在乳腺泌乳期分化发育中的作用。我们采用MMTC-Cre介导的Zfhx3乳腺特异性敲除小鼠,收集了泌乳期2天的乳腺组织。乳腺组织的全组织染色表明,Zfhx3敲除后显著抑制了乳腺泌乳期的发育,表现为乳腺腺泡发育的减少。H&E染色给了我们更多的提示,结果表明,相对于野生型的小鼠乳腺,Zfhx3敲除后的乳腺在泌乳期2天表现为分泌活动的不活跃。利用realtime PCR检测相应的β-casein及一些其他与乳腺泌乳分化的关键基因的表达呈现明显下降。利用免疫组化分析相应组织,发现与体外模型的结果一致,乳腺泌乳期发育的关键因子Stat5磷酸化的水平显著下降,且这一下降与Prlr的表达下降存在逻辑上相关性。
  利用双荧光素酶报告基因系统,我们进一步探索了Zfhx3与Prlr启动子之间的潜在结合,结果表明,在Zfhx3敲减后,Prlr基因5'上游的部分区域呈现启动子活性的下降,这进一步确定了Zfhx3与Prlr启动子区域的潜在结合。
[硕士论文] 赵丹
概率论与数理统计 南开大学 2014(学位年度)
摘要:当使用传统的控制图来检测一个特殊事件发生率是否变化时,常常假设数据之间是独立的,但是在现实应用中,很多数据都存在一定的相关性。
  在这篇文章中,我们基于两参数INARCH模型,主要研究样本量随时间变化的INARCH(1)模型。INARCH(1)模型是一阶自回归模型,满足这样模型的数据具有相关性。数值模拟表明前提假设数据独立性的传统的CUSUM控制图对相关性都不具有稳健性。于是我们基于对数似然比,结合条件Poisson分布,建立了一个新的CUSUM控制图用来进行相关性数据的检验。
  在不同情形下,我们将提出的新控制图VLCUSUM控制图与传统CUSUM控制图进行性能比较,分别检验其在样本量逐渐增加,样本量快速增加,样本量逐渐减少,以及样本量均匀分布情况下的性能表现。在上述样本量变化状态下,通过随机数值模拟将本文提出的控制图与其他控制图进行比较,其中主要考察控制图在失控状态下的平均运行长度ARL。通过比较发现,总体上本文提出的新控制图在数据具有相关性下具有明显的优势。
[硕士论文] 赵丹
生物物理学 南开大学 2013(学位年度)
摘要:在骨的形成过程中,成骨细胞胞外钙离子浓度([Ca2+]o)会有所升高(从2mM升高至8~40 mM),外钙浓度上升直接抑制破骨细胞的活性,刺激成骨细胞活性。有报道称,细胞外钙离子浓度升高会促进成骨细胞的增殖,但是[Ca2+]o升高对成骨细胞的刺激机制目前尚未明了。在本研究中,我们发现[Ca2+]o升高引发成骨细胞SOCE(Store operated calcium entry)机制,并对细胞增殖有着促进作用。首先我们发现升高[Ca2+]o可以引起细胞内钙离子浓度[Ca2+]i上升,这种[Ca2+]i上升主要是由于细胞外钙内流引起的。SOCE机制的阻断剂2-APB与细胞内钙释放抑制剂TMB-8都能抑制这种现象,而电压门控的钙离子通道(Cav)抑制剂硝苯地平(nifedipine)和维拉帕米(verapamil)都不能抑制该现象。NPS2390和U73122能抑制这种[Ca2+]i上升,NPS2390是钙敏感的受体通道(CaSR)的特异性抑制剂,U73122是磷脂酶C(PLC)的抑制剂。我们同样发现[Ca2+]o升高对成骨细胞增殖的促进作用,增殖被2-APB,TMB-8,NPS2390和U73122抑制,不受nifedipine和verapamil的影响。此外,GdCl3是一种非生理性的CaSR的激动极,可以引起[Ca2+]i的升高及细胞增殖。以上结果显示,成骨细胞[Ca2+]o上升活化CaSR,并激活PLC,引起细胞增殖。
   人体的骨关节系统一直处于受力状态,成骨细胞是骨关节系统形成的源动力,也是骨关节系统中力学信号感受与响应的的关键细胞群,机械力刺激对成骨细胞的生长增值、分化分泌、细胞骨架重组等多种生理功能有显著影响,不过,关于力学因素调节成骨细胞功能的详细机制尚未阐明。在本文中,我们发现流体剪切力(Fluid Shear Stress,FSS)可以刺激成骨细胞引起细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)上升,并且诱导细胞向外分泌ATP,这种作用很可能是通过TRPV4通道的活化来实现的。首先,我们证明了TRPV4通道基因在成骨细胞中的表达。然后,我们采用0.12 Pa、0.24 Pa、0.48 Pa和1.2 Pa的FSS来刺激成骨细胞,[Ca2+]i及细胞外液中的ATP浓度都随之升高,其中GdCl3、钌红(RR)和EGTA都能抑制细胞分泌ATP,GdCl3是机械敏感离子通道MSCC(mechanosensitivecation-selective channel)的阻断剂、辽红(Ruthenium Red,RR)是香草素受体偶联的离子通道(TRPV)类阻断剂、EGTA是细胞外钙离子的鳌合剂。此外,4α-PDD是TRPV4通道特异性激动剂,它能刺激细胞分泌ATP,且ATP的分泌受GdCl3、RR和EGTA的抑制。除了4α-PDD,另一组对照实验中,我们发现低渗透压的细胞外液同样能使成骨细胞分泌ATP。通过以上结果,我们得出结论:剪切力FSS可以刺激成骨细胞引起细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)上升,并且诱导细胞向外分泌ATP,这种作用很可能是通过TRPV4通道的活化来实现的。
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