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摘要:目的:建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂.方法:酶切质粒pGL4-WT和pGL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,分别插入到慢病毒载体pLVX-IRES-Neo多克隆位点.酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK 293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶mRNA表达.最后用已知阳性无义突变通读剂G 418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性.结果:经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,与pLVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体pLVX-WT、pLVX-MUT,EcoR Ⅰ单酶切、Nhe Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶mRNA表达;阳性通读剂G418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%.结论:成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂.
摘要:研究发现,30%人类致病基因突变属无义突变,基因编码区发生的无义突变可致蛋白翻译在元义突变位点提前终止,导致蛋白功能缺失,引起包括遗传病、肿瘤在内的众多疾病。少数化合物具有无义突变通读作用,可诱导全长蛋白翻译而恢复部分功能,是一种前景广阔的潜在治疗药物。筛选新型无义突变通读剂至关重要,这些工作有赖于通读活性检测方法的发展和完善。目前通读剂活性检测方法主要包括两大类型,原理都是基于蛋白截断试验(protein truncation test,PTT)或报告基因系统。本文较全面地回顾了无义突变通读活性检测方法的发展及最新进展,为高通量筛选方法的建立提供参考,从而进一步推动新型通读剂的筛选工作,发现具有临床药物潜力的候选化合物,用以治疗无义突变所致众多疾病。
摘要:30%人类致病基因突变属无义突变,无义突变可导致众多疾病.无义突变通读剂具有无义突变通读活性,可诱导基因恢复其功能,属于基因治疗药物.基因编码区发生的无义突变可致蛋白翻译在无义突变位点提前终止,导致蛋白功能缺失,引起包括遗传病、肿瘤在内的众多疾病.少数化合物具有无义突变通读作用,可诱导全长蛋白翻译,是一种潜在的治疗药物.目前通读剂活性检测方法主要包括蛋白质截短试验和报告基因系统两大类型.本文回顾了无义突变通读活性检测方法的发展及最新进展,为药物高通量筛选方法的建立提供参考.
[硕士论文] 谢骁祥
公共卫生与预防医学 武汉科技大学 2017(学位年度)
摘要:目的:
  建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株,用以筛选新的无义突变通读剂。
  方法:
  酶切质粒pGL4-WT和pGL4-MUT,得到野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,分别插入到慢病毒载体pLVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后,将重组载体包装成慢病毒颗粒,感染HEK293细胞,单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株,提取总RNA,经逆转录PCR方法验证荧光素酶mRNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G418处理细胞,Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平,同时分析荧光素酶活性。
  结果:
  经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA,与pLVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体pLVX-WT、pLVX-MUT,EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入,PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶mRNA表达;阳性通读剂G418处理细胞后发现,HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白,荧光素酶活性也基本相同,而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白,无荧光素酶活性,处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达,其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20%。
  结论:
  成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株,可用于筛选新的无义突变通读剂。
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