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摘要:利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER -PYGO1).首先,针对 PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSUPER 质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1.通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆.通过RT-PCR和Western blot检测pSUPER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果.pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染 pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低.因此,靶向PYGO1的 pSUPER RNAi 载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础....
摘要:调控骨骼肌发育的分子机制尚不完全明了.有证据显示LIM-only蛋白FHL1与骨骼肌的生长以及人体骨骼肌病有关联,但FHL1在骨骼肌发育中的作用还有待阐明.本文以斑马鱼为模型研究了FHL1在斑马鱼中的一个同源基因fhl1A的表达模式及其在骨骼肌发育中的功能.胚胎整体原位杂交结果显示,3-体节时fhl1A在体节处不表达;10-体节期fhl1A在体节强表达,而20-体节期fhl1A仍在体节表达,但表达水平降低.这种变化的表达模式提示fhl1A可能参与调控骨骼肌的发育.敲低fhl1A导致骨骼肌的形态发生异常.分别用F59和4D9抗体进行免疫荧光分析,结果显示敲低fhl1A导致24hpf胚胎的肌球蛋白明显减少,但Engrailed蛋白没有明显变化,表明fhl1A可影响慢肌的发育但不影响慢肌前体细胞的发育。另外,RT-PCR结果显示,敲低fhl1A的24hpf胚胎中pax7a、pax7b以及sk MLCK的m RNA水平显著下降。同时,pax7抗体标记的卫星细胞数目明显减少。RA处理导致10-体节期胚胎的fhl1a表达明显上调,而RA信号通路的抑制剂DEAB的处理则显著抑制了fhl1a的表达,提示内源性fhl1a的表达受RA信号通路的调节。总之,这些实验结果表明fhl1A在体内对于调节骨骼肌发生和卫星细胞的数目是必需的。
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