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[硕士论文] 谈烨明
生物学 曲阜师范大学 2017(学位年度)
摘要:m6A(N6-methyladenosine)是真核生物messager RNA(mRNA)和long non-coding RNA(lncRNA)最为普遍的修饰。早在上个世纪七十年代,m6A修饰就已经被发现。而它的生物学意义并不清楚。过去曾一度认为m6A修饰是不可被逆转的,以致没有得到足够的重视。随着去甲基转移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)的发现,以及高通量测序等先进的技术的应用后,又掀起了m6A的研究热。近些年来,对m6A的生理功能方面取得了重要的研究成果,然而,m6A表观修饰如何影响生物个体的生殖细胞分化过程并不清楚。本研究利用经典模式生物果蝇作为模型,深入探索m6A调控果蝇早期生殖细胞分化的机制,揭示其分子基础,对于整个表观遗传研究领域和不孕不育等相关疾病发病机的理论研究具有重大意义。
  我们利用Me-RIP技术对果蝇卵巢细胞中的m6A进行了测序分析,得到了与生殖发育密切相关的mRNA上的m6A信息。总共检测到了4442个m6A peak位点。m6A peak在5’UTR和3’UTR均有富集。与已报道的体外细胞中m6A的分布相比,果蝇生殖细胞中的m6A在5’UTR的富集程度更高。这提示,果蝇卵巢细胞中的mRNA上的m6A修饰可能参与转录和翻译调节。聚类分析则显示,mRNA上的m6A在卵子发生、卵巢滤泡细胞发育等生殖过程中显著富集。
  对测序数据进一步分析发现,vasa、sxl(sex leathal)、orb(oo18 RNA-binding protein)、nanos、oskar、pumilio等与早期生殖发育密切相关的基因mRNA上均有m6A修饰。其中sxl的m6A修饰已有报道,也佐证了此次m6A测序的可靠性。通过MeRIP-qPCR,我们先确定了卵巢中vasa、sxl、orb、bam四个基因的mRNA存在m6A修饰,其中orb的m6A富集比例较高,可能有较高的m6A修饰比例。
  应用CRISPR/Cas9系统构建的m6A甲基转移酶复合物组分ime4、dMETTL14突变体果蝇。其中,得到了ime4插入突变体,dMETTL14缺失突变体。二者发生的突变均发生在第二个外显子中。ime4和dMETTL14两种基因的纯合突变体果蝇羽化后存活时间较短,无法建立稳定系产生后代。育性统计发现,ime4突变体果蝇生育能力减弱。16.67%的 ime-/-突变雌性果蝇无法产生后代,dMETTL14突变体果蝇也有类似情况。免疫荧光观察发现,ime-/-突变体果蝇卵巢germarium形态异常,spectrosome数量增多,CB等早期生殖细胞分化异常,滤泡细胞不能正常包裹Cyst。但未观察到dMETTL14-/-突变体果蝇有相应的表型。
  荧光定量PCR显示,在ime-/-纯合突变果蝇中,vasa和bam的mRNA水平降低,sxl的变化不大,而orb的mRNA提高了30%。以此为基础,进一步分析并确认突变体表型发现,与杂合突变体相比,纯合突变体中Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。
  故我们得到以下结论:
  (1)通过果蝇卵巢m6A甲基化修饰Me-RIP测序,筛选到了orb等与早期生殖细胞分化密切相关的基因mRNA上的m6A位点;
  (2)m6A甲基转移酶纯合突变体果蝇育性下降;
  (3)甲基转移酶纯合突变体果蝇卵巢早期生殖细胞分化出现异常;
  (4)纯合突变体果蝇中orb mRNA表达量升高,与之相对应的,Orb蛋白在早期生殖细胞发育谱系中提前表达。总之,本实验表明了,mRNA m6A修饰与果蝇早期生殖细胞的分化密切相关。这将有助于我们揭示mRNA上的m6A的在体生物学功能,亦可为生殖相关疾病的诊断和治疗提供线索。
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