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[硕士论文] 许振兴
生物工程 山东大学 2017(学位年度)
摘要:能源、资源、环境问题是21世纪制约社会经济可持续发展的主要瓶颈。为进一步解决能源紧缺问题,从海洋中寻找新的生物能源途径越来越引起科研人员的重视。海洋面积占地球总面积的70%以上,其中蕴藏丰富自然生物资源,并且含有大量可进行生物质转化的藻类。琼胶作为一种海洋功能多糖,是海洋红藻细胞壁的主要成分,总量巨大,是生物质能转化的重要来源之一。另外,琼胶经水解后的寡糖也由于水溶性好,易被机体吸收的特点,在食品,医药,化妆品等领域有着巨大应用前景。微生物作为降解琼胶的初级消费者,是研究琼胶生物质转化以及制备琼胶寡糖的主要物种来源。因此,本文以细菌的琼胶降解为研究主线,开展了一系列研究工作。
  首先,本文完成了包括两株琼胶降解菌在内的四株海洋新菌的分类鉴定工作。分离自青岛养殖池海水并且具有琼胶降解能力的菌株QM50T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白、DNA以及吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,基因组分析以及16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为科尔韦尔氏菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶科尔韦尔氏菌(Colwellia agarivorans sp.nov.)。分离自条斑紫菜表面并且具有琼胶降解能力的菌株HZ1T,革兰氏阴性菌,可以水解琼脂、明胶、酪蛋白以及吐温80,呼吸醌类型为MK-6,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和三个未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征以及16S rRNA序列的系统发育分析,菌株HZ1T为黏着杆菌属的一个新物种,建议将其命名为噬琼胶黏着杆菌(Tenacibaculum agarivorans sp.nov.)。分离自鲨鱼腮的中度嗜盐菌SS9T,革兰氏阴性菌,最适生长盐度为6%,能够积累PHA,呼吸醌类型为Q-9,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。结合不同生理生化特征,16S rRNA序列的系统发育分析以及MLSA分析,该菌为是盐单胞菌科的一个新属新种,建议将其命名为橙色鲨鱼球菌(Pistricoccus aurantiacusgen.nov,sp.nov.)。分离自威海近海沉积物的菌株N211T,革兰氏阴性菌,可以水解明胶和吐温80,呼吸醌类型为Q-8,主要极性脂为磷脂酰乙醇胺,磷脂酰甘油和一种未被鉴定的脂质。结合不同生理生化特征和16S rRNA序列的系统发育分析,该菌为深海杆菌属的一个新物种,建议将其命名为沉积物深海杆菌(Thalassotalea sediminis sp.nov.)。另外,还对鉴定的两株琼胶降解菌进行了基因组测序,结果显示菌株QM50T的基因组大小为4.7 Mb,GC含量为35.8%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌株存在5条β-琼胶酶基因,4条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。菌株HZ1T的基因组大小为5.6 Mb,GC含量为30.9%,利用Swiss-Prot数据库注释,该菌存在11条β-琼胶酶基因,1条α-琼胶酶基因,2条卡拉胶酶基因和1条褐藻胶酶基因。并且这两株菌还注释出不完全相同的半乳糖代谢通路。
  然后,本文对来源于本实验室之前鉴定的两株琼胶降解菌HQM9T和QIT的11条琼胶酶基因和6条新琼二糖水解酶基因进行了外源表达分析。利用生物信息学分析,除琼胶酶AgaAJ属于GH86家族,琼胶酶Q1B2属于GH118家族外,其余9条琼胶酶基因都属于GH16家族,6条新琼二糖水解酶基因属于GH117家族。并且经过对琼胶降解酶基因的外源表达过程,我们成功构建了11条琼胶酶的基因工程菌,经表达检测及酶活分析,9条琼胶酶进行了重组蛋白表达并显示出一定活性。而6条新琼二糖水解酶基因中只有四条基因被成功表达,除了NABH1表达可见的可溶性重组蛋白外,其余3条基因均表达包涵体,经底物水解检测,这四条重组的新琼二糖水解酶没有显示出降解底物的能力。对多个重组酶进行纯化,最后利用亲和层析结合包涵体复性的方式成功纯化出重组琼胶酶Q1B1,对其进行生理生化特征鉴定,重组酶Q1B1在底物为1%时的比酶活为222.84U/mg,并且具有琼胶底物专一性,它的最适反应温度为40℃,最适底物浓度为1.6%,最适反应的pH值为8,DTT对酶活的促进有很大影响。纯化后的重组酶以琼脂糖为底物时的最终降解产物为新琼四糖和新琼六糖,它的最小降解底物为纯的新琼六糖。
  最后,本文还从基因转录水平分析了菌株Q1T在琼脂糖诱导条件下,在不同时间琼胶降解相关基因的表达差异。结果显示琼胶降解酶基因的表达集中于菌株诱导生长的前期,并随着菌株生长持续减弱,至菌株生长至稳定期后期时,琼胶降解基因基本停止表达。另外,根据琼胶降解基因在基因组上的分布,菌株Q1T中的琼胶降解酶基因大部分可能属于单独调控型,虽集中表达,但表达量只与诱导条件有关,而与基因所处位置无关。
摘要:目前海藻多糖降解主要依赖物理化学的方法,且产生的相当部分寡糖很难被现有的工业微生物菌株降解和利用,阻碍了海藻生物质转化技术的发展,因此解析微生物降解利用海藻多糖的机制有助于海藻生物质能源的转化。琼胶是最为丰富的海藻多糖之一,其完全生物降解依赖于新琼二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase,NABH)的参与。本文以新分离鉴定并进行基因组测序的一株海洋噬琼胶菌HQM9 (Aquimarina agarlyticus HQM9)为研究对象,对其新琼二糖水解酶基因及其酶学特性进行研究。基因组信息分析发现该菌含有28个可能的琼胶酶基因,且编码酶均属于β-琼胶酶。利用生物信息学分析,HQM9中含有6个潜在的编码新琼二糖水解酶(AaNABH)基因,与已知的NABH相似性36%-70%,且均具有典型的催化结构域。研究中基于PET表达系统对这6个基因进行克隆和异源表达,系统地鉴定其功能、酶学特性。进而推测AaNabh在HQM9降解利用琼胶过程中的作用。研究结果将有助于进一步加深对琼胶降解机制的了解,为今后琼胶代谢工程菌株的改造及海藻生物能源的转化提供理论依据。
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