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摘要:紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上被广泛种植的一种优质牧草.盐胁迫对紫花苜蓿的生长和产量具有明显抑制作用.为了理解南方型紫花苜蓿(M.sativa'Millennium’)受盐胁迫的内在分子机制,挖掘其与耐盐密切相关的功能基因.以250 mmol/L NaCl处理72 h的南方型紫花苜蓿耐盐突变体叶片进行Illumina HiSeqTM 2000高通量转录组测序,并对所获得的差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG) pathway生物信息学分析,获得可能耐盐潜在靶标基因.同时,挑选8个差异表达基因验证测序结果的可靠性.结果表明,过滤后对照(control,CK)和盐处理(salt stress,ST)样本分别保留了60 395 324和60 303 692对reads,其中54.18%和53.77%的reads能精确比对到参考序列蒺藜苜蓿(M.truncatula)上.差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)结果显示,在样品中共检测到30 900个基因表达发生改变,其中4 187上调表达,3 507下调表达.GO功能分析显示,差异表达基因主要表现在结合、催化活性、细胞组分和细胞等.KEGG Pathway分析显示,差异表达基因广泛涉及次生代谢、代谢途径及苯丙素的生物合成.另外,筛选了与紫花苜蓿盐胁迫应答相关的基因谷胱甘肽硫转移酶、超氧化物歧化酶Cu/Zn蛋白、L-抗坏血酸过氧化物酶、类受体蛋白激酶、诱导类受体蛋白激酶、蔗糖非发酵型蛋白激酶、类钙调素蛋白、胆碱单加氧酶、1-吡咯啉-5-羧酸合成酶、蛋白磷酸酶2C、海藻糖磷酸酯酶等和AP2类乙烯响应的转录因子、bHLH36转录因子、NAIl转录因子、bZIP转录因子、C3H锌指蛋白、核酸结合转录因子活性、Myb转录因子、NAC转录因子蛋白、序列特异性DNA结合转录因子蛋白和WRKY转录因子等.本研究为揭示紫花苜蓿耐盐分子机制提供了基础资料....
[期刊论文] 裴翠明 张振亚 马进
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:以南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)30 d苗龄的实生苗为实验材料,分析正常培养和250 mmol/L NaC1处理72 h后叶片中的蛋白表达变化,以期从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫的分子机制.采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫的差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能的耐盐潜在靶标蛋白.结果表明,共鉴定3 712个定量蛋白,417个表达量有显著差异的蛋白质(变化倍数≥1.2,P≤0.05),其中包含291个表达上调的蛋白,126个表达下调的蛋白.按照基因本体(Gene Ontology,GO)分类体系,对差异蛋白归类分析,揭示其亚细胞定位和分子功能.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、吞噬体、脂肪酸代谢和光合作用等(P<0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)<0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到光合作用(7%)、信号传递(3%)、防御(2%)、碳水化合物代谢(11%)、氨基酸代谢(7%)、脂类代谢(5%)、其它代谢(7%)、蛋白质合成、加工与降解(18%)、细胞结构、分裂和细胞骨架(3%)、抗氧化物(6%)、能量产生与转运(7%)、膜和胞内运输(7%)及未知功能蛋白类(16%).差异表达蛋白中与抗氧化物、能量产生与转运、防御和信号传递及代谢等相关的蛋白表达量总体上调,而与蛋白质合成、加工与降解和光合途径相关蛋白表达量总体下调.研究发现,细胞色素P450、PSⅡ放氧增强蛋白、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、甘露糖-6-磷酸还原酶、海藻糖-6-磷酸合酶、天冬氨酸转氨酶、E3泛素连接酶和H+-ATP酶C亚基蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,能有效地筛选出南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能在紫花苜蓿耐盐调控过程中发挥重要作用,该研究为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制提供理论依据....
[期刊论文] 马进 郑钢 裴翠明 张振亚
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:为了从基因和蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿Millennium为材料,对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品叶片进行转录组和蛋白质组关联分析.结果表明,定量蛋白和基因关联系数为0.2485;变化趋势相反差异蛋白和基因表达的关联系数为-0.2440;变化趋势相同差异蛋白质和基因表达的关联系数为0.8122.鉴定出109个与差异基因表达趋势相同的差异蛋白,其中77个上调,32个下调,这些差异蛋白功能涉及光合作用、抗氧化物、信号传递、翻译后修饰、翻译和分子伴侣、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其它未知功能蛋白等.下调表达的蛋白主要与光合作用相关,而上调表达的蛋白主要参与了抗氧化物、信号传递和胁迫防御等.此外,关联发现了与紫花苜蓿盐胁迫响应相关的Ⅲ类过氧化物酶、铁蛋白、谷胱甘肽S一转移酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、LRR类受体激酶、ABA反应蛋白、钙联接蛋白2、液泡H+-ATP酶C亚基和NADP-苹果酸酶等差异蛋白.本研究通过高通量多组学数据的关联分析,发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白(基因),这为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础....
[期刊论文] 马进 郑钢 裴翠明 张振亚
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:为了从蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ‘Millennium’)适应盐胁迫的分子机制,本研究以30 d苗龄的南方型紫花苜蓿实生苗为材料,分析正常培养和250 mmol/L NaCl处理72 h后根中的蛋白表达变化,采用同位素相对标记与绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合双向液相色谱与串联质谱(2-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)定量蛋白质组技术鉴定南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,对所获得差异蛋白进行生物信息学分析,筛选出可能耐盐潜在靶标蛋白.同时,选择5个差异表达蛋白进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证.结果表明,共鉴定3 857种定量蛋白,534种差异蛋白(变化倍数≥1.2,P<0.05),其中表达上调的281种,表达下调的253种.基因本体(Gene Ontology,GO)分子功能提示这些差异性蛋白主要参与转运活性、催化活性和酶调控活性.京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路显著性富集于代谢途径、次生代谢产物生物合成、苯丙氨酸代谢和核糖体等(P< 0.05,错误发现率(false discovery rate,FDR)< 0.05).成功鉴定的差异蛋白分别涉及到信号传递(8.99%)、抗氧化物(7.68%)、防御(5.61%)、蛋白质合成、加工和降解(14.79%)、能量产生与转运(5.81%)、代谢(26.97%)、膜与胞内运输(5.62%)和细胞结构、分裂和细胞骨架(2.06%)等.差异表达蛋白中与信号传递、抗氧化物和防御等相关的蛋白表达量总体上调,而与代谢和能量产生与转运相关蛋白表达量总体下调.qRT-PCR实验发现,mRNA与蛋白质表达水平并不一致.研究发现组氨酸磷酸转移蛋白、丝裂原活化蛋白激酶、h类硫氧还蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶基因、鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate, GDP)解离抑制因子、脂质转移蛋白、β-1,2-木糖基转移酶和H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等可能是紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白.本研究采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS技术,有效地筛选出南方型紫花苜蓿根部响应盐胁迫差异表达蛋白,为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础....
[期刊论文] 裴翠明 张振亚 马进
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北大核心 CSTPCD CSCD
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摘要:以南方型紫花苜蓿‘Millennium’为材料,以正常培养(WT_CK2)和250 mmol·L-1 NaCl胁迫下72 h时( WT_N2)条件下的2个样品叶片进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子基因。同时随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。紫花苜蓿叶片在250 mmol·L-1 NaCl胁迫下72 h时,检测到表达量差异达到2倍以上的基因共7497个,其中包括隶属于46个转录家族474个转录因子在盐胁迫下的差异表达,上调242个,下调232个。 bHLH, NAC, WRKY和C2H2转录家族成员基因70%以上表达上调。实时荧光定量PCR分析表明4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外,还发现大量紫花苜蓿盐胁迫应答的转录因子候选基因如MsERF110,MsERF071,MsbHLH36,MsZFP,MsHSFB-3,MsMYB,MsNAC和MsWRKY等。同时,也揭示了紫花苜蓿叶片对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。...
[期刊论文] 马进 郑钢 裴翠明 张振亚
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用。为了解析转录因子在南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿 Medicago sativa ‘Millennium’为材料,以正常培养(WT_ck1)和氯化钠(盐)胁迫(WT_N1)条件下的2个样品根系进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子基因。同时,随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR(3次重复),验证转录组测序技术(RNA-Seq)结果的可靠性。结果表明:紫花苜蓿根系在250 mmol·L-1氯化钠胁迫下72 h,共检测到31907个基因表达量发生了改变,表达量差异达到2倍以上的基因共2758个。其中,隶属于38个转录因子家族199个转录因子在盐胁迫下差异表达,上调表达104个,下调表达95个。在各转录因子家族中,盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其后分别是AP2-EREBP, bHLH, WRKY, NAC和GRAS基因家族,这暗示了紫花苜蓿根系对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。 qRT-PCR分析表明:4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外, MsERF-2b, MsbHLH, MsbZIP, MsGRAS, MsNAC, MsMGT-3a 和MsWRKY等转录因子被选为与盐胁迫应答相关的候选转录因子。该研究结果为阐明植物对盐胁迫的应答机制提供了新的线索。图3表3参36...
[期刊论文] 裴翠明 张振亚 马进
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CSTPCD 北大核心
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摘要:转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用.以南方型紫花苜蓿Medicago sativa‘Millennium’的耐盐突变体为材料,以正常培养(MT_CK2)和盐胁迫(MT_ N2)条件下的2个样品叶片进行转录组测序分析,并进行qRT-PCR验证RNA-Seq结果的可靠性,研究耐盐突变体叶片盐胁迫应答相关转录因子基因.结果表明:经过250 mmol/L NaC1胁迫72 h,共检测到30 900个基因表达量发生了变化,7 694个基因差异表达,共有隶属于50个转录家族的422个转录因子发生了差异表达,上调表达268个,下调表达154个.盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是WRKY、NAC、bHLH和AP2-EREBP转录家族.此外,候选出MsANT、MsbHLH36、MsNAI1、MsbZIP、MsbZIP73A、MsC3H、MsMYB85、MsNAD、MsMYB、MsNAC、Ms Trihelix和Ms WRKY等与盐胁迫应答相关的重要转录因子.本研究为揭示紫花苜蓿盐胁迫分子机制奠定基础....
[期刊论文] 张振亚 裴翠明 马进
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CSTPCD 北大核心
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摘要:通过高通量多组学数据的整合分析,可以为诠释植物耐盐分子机制提供新思路。以南方型紫花苜蓿‘Millennium’为材料,对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品根系进行转录组和蛋白质组关联分析,以期发现紫花苜蓿耐盐相关候选基因。结果表明:蛋白质组和转录组相关性并不高,定量蛋白和基因关联系数为?0.0013;变化趋势相反差异蛋白和基因的表达关联系数为?0.3648;变化趋势相同差异蛋白和基因的表达关联系数为0.2620。鉴定出与差异蛋白表达趋势相同的差异基因25个,上调表达14个,下调表达11个,这些差异基因涉及代谢、信号转导、蛋白质降解、防御、抗氧化、细胞骨架、膜与转运、转录和其他未知等方面的功能。另外,关联分析发现TIP1;1型水通道蛋白(AQP)、钙调素结合蛋白(CaMBP)、富亮氨酸重复类受体激酶(LRR-RLK)、C2H2型锌指蛋白(ZFP)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glu)、晚期胚胎富集蛋白(LEA)、蔗糖合成酶(SS)、ATP结合盒转运蛋白(ABC)和III类过氧化物酶(PRXs)等差异基因可能在紫花苜蓿耐盐中发挥重要作用。该研究表明:利用转录组和蛋白质组的关联研究技术可以有效地发现紫花苜蓿耐盐相关候选基因,为阐明紫花苜蓿对盐胁迫的应答机制提供新线索。...
[期刊论文] 马进 郑钢 裴翠明 张振亚
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CSTPCD 北大核心
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摘要:在不同抗氧化途径中AsA-GSH是最重要的循环系统,为明确抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)在紫花苜蓿耐盐性中的作用。以紫花苜蓿品种‘Millennium’及其耐盐突变体为材料,研究其在200 mmol·L-1胁迫下的活性氧代谢及AsA-GSH循环的变化。结果表明, NaCl胁迫下突变体叶片中的过氧化氢(H2O2)含量、超氧阴离子(O2ˉ·)产生速率和丙二醛(MDA)含量、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量、脱氢抗坏血酸(DHA)含量显著低于野生型。突变体叶片中GSH/GSSG和AsA/DHA的比值高于野生型。NaCl盐胁迫下突变体叶片中H2O2与DHA含量呈显著正相关,与AsA/DHA和GSH/GSSG比值呈负相关。同野生型相比,突变体叶片中在胁迫期间能够保持较高且相对协调平衡的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性。说明突变体体内AsA-GSH循环能够快速有效地运转,维持较强抗氧化物质的再生能力,从而提高抗氧化胁迫能力。该研究结果表明AsA-GSH循环效率是紫花苜蓿耐盐机制的重要生理基础。...
[硕士论文] 裴翠明
园林植物与观赏园艺 浙江农林大学 2017(学位年度)
摘要:中国海域辽阔,滨海盐碱地只有小部分被利用耕种,大部分还为荒地和海涂地,海岸带拥有大量的盐碱土待开发利用,是重要的后备土地资源。滨海盐碱地改良和生态绿化是中国沿海城市化进程中一项异常艰巨的重要难题。根据近年来国内外实践经验,筛选耐盐植物是进行滨海盐碱地生物改良和生态绿化最具光明前景的经济有效的方法。紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是一种具有较强耐盐性的豆科植物,栽培历史悠久,在全球广泛种植,具有一定的观赏价值,是进行盐碱地改良和园林绿化的理想植物。本研究以高秋休眠级南方型紫花苜蓿‘Millennium’的耐盐突变体为材料,进行转录组测序分析,筛选盐胁迫响应差异基因,并对其进行GO功能显著性分析、KEGGPathway显著性富集分析和转录因子分子,已期探究耐盐相关基因参与的主要生物学功能和代谢途径,为进一步研究紫花苜蓿耐盐分子机制,培育耐盐新品种奠定基础。本研究结果如下:
  1、通过对南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗进行250mmol/L NaC1处理0、24、48、72和96h时生理指标的测定,发现在盐胁迫72h内,叶片相对含水量持续降低,脯氨酸含量、相对电导率、MDA含量和SOD活性持续升高;在盐胁迫大于72h后,叶绿素含量和SOD活性明显下降,脯氨酸含量、相对电导率和MDA含量升高幅度增大。表明250mmol/L NaCl处理72h是紫花苜蓿耐盐突变体幼苗盐胁迫响应的最佳时间,为接下来耐盐分子机制研究提供了依据。
  2、利用RNA-Seq技术,经过250mmol/L NaCl胁迫72h,南方型紫花苜蓿耐盐突变体幼苗叶片样品中共检测到30900个基因表达量发生改变,其中7694个基因被定义为差异基因(4187个基因上调表达,3507个基因下调表达),包括隶属于50个转录家族的422个转录因子(268个转录因子上调表达,154个转录因子下调表达)。
  3、实时荧光定量PCR验证表明,随机选择的8个差异表达基因在盐胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致,表明了转录组测序数据的可靠性。
  4、GO功能显著性分析显示,差异表达基因的生物学功能主要表现在催化活性、结合、细胞组分、细胞、代谢过程和细胞过程。KEGG Pathway显著性富集分析显示,差异表达基因广泛涉及代谢途径和次生代谢产物生物合成。候选出MsGST、MsL-APX、MsGPX、MsRLK、MsSIK、MsSnRK、MsCMLs、MsCMO、MsMIP、MsP5CS1、MsP5CS3、MsABCB、MsWBC、MsLEA3和MsPP2C等重要耐盐相关基因。转录因子分析发现,应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是WRKY、NAC、bHLH、AP2-EREBP和GRAS等基因家族。候选出MsA lfin-like、MsERF110、MsANT、MsbHLH36、MsNAI1、MsbZIP、MsC3H、MsGRAS、MsNAD、MsMYB、MsMYB85、MsNAC、MsRWP-RK、MsTrihelix和MsWRKY等耐盐相关转录因子。
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