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[硕士论文] 袁硕
口腔临床医学 福建医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  本课题的研究旨在探索基质金属蛋白酶1和7(MMP1\7)是否为人舌鳞状细胞癌的促癌基因以及其是否影响舌癌细胞增殖迁移及侵袭,以期为舌癌的早期分子诊断以及靶向治疗提供实验基础和临床证据。
  方法:
  第一部分:选取收集的五对人舌鳞状细胞癌术后标本进行癌和癌旁组织的转录组二代测序,得到相应的差异基因MMP1\7,为了验证结果的可靠性,另选53对舌癌标本运用RT-PCR技术检测其mRNA表达的情况,并通过免疫组化实验进一步确认其在蛋白水平表达是否存在差异。
  第二部分:体外合成相应的siRNA干扰序列和经过测序鉴定序列正确的过表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1–Puro-MMP1\7(以下简称pCDH-MMP1\7),转染人舌癌细胞CAL27\SCC9后利用RT-PCR技术和蛋白免疫印迹实验分别在mRNA和蛋白水平验证MMP1\7的干扰和过表达效果;通过CCK8增殖实验和平板克隆形成实验探讨当抑制和过表达MMP1\7基因后舌癌细胞增殖能力的变化;采用划痕愈合实验以及侵袭小室实验研究抑制和过表达MMP1\7基因对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。
  第三部分:本课题组前期研究发现,Notch信号通路和WNT信号通路与舌癌细胞株的增殖、迁移和侵袭密切相关,且相关文献报道MMPs可作为这两个信号通路的下游靶基因共同调控恶性肿瘤的迁移侵袭[1,2],因此分别抑制Notch信号通路和WNT信号通路后,利用蛋白免疫印迹技术在蛋白水平上检测MMP1表达的变化,探究MMP1是否作为Notch信号通路和WNT信号通路的靶基因影响舌癌的迁移侵袭;鉴于TIMP1为MMPs的天然抑制剂分子,两者表达失衡被认为是很多肿瘤迁移侵袭的原因之一,选取15对舌癌标本检验TIMP1mRNA在舌癌组织与癌旁组织表达情况,探讨MMP1\7及TIMP1在舌癌中可能的关系;另外根据之前相关文献报道,干扰MMP7基因后基质金属蛋白酶其他家族成员MMPs、其天然抑制剂TIMPs以及CDH1的表达将发生改变,因此在CAL27\SCC9人舌癌细胞中干扰MMP7后利用RT-PCR法检测这些分子在mRNA水平的变化情况。
  第四部分:经过前面体外细胞学实验得到MMP7基因可影响舌癌细胞的迁移和侵袭能力,为了探索其在体内是否也发挥了相似的作用,利用前期课题组经体内筛选得到的舌鳞状细胞癌裸鼠正位淋巴道高转移细胞株(LN4),shRNA沉默MMP7基因后观察舌癌细胞转移能力的变化。
  结果:
  第一部分:通过对人舌癌术后标本的转录组测序得到MMP1\7在癌组织中较癌旁组织为高表达,而RT-PCR结果显示其中的50对标本MMP1在癌组织表达量高于癌旁,MMP7则有45对;免疫组化结果同样显示MMP1\7在癌组织中表达较高。
  第二部分:siRNA和pCDH-MMP1\7质粒转染CAL27\SCC9细胞后,RT-PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示,与对照组相比,实验组MMP1\7表达明显下调和上调;CCK8增殖曲线和平板克隆实验证明经MMP1\7siRNA处理后的细胞增殖能力明显降低,质粒过表达后增殖能力增强;划痕愈合实验、侵袭小室实验证实,抑制MMP1\7后CAL27\SCC9细胞的迁移侵袭能力随之降低,质粒过表达后迁移能力则增强。
  第三部分:抑制Notch信号通路和WNT信号通路后MMP1蛋白表达明显下调;RT-PCR实验结果表明CAL27细胞干扰MMP7后在mRNA水平MMP1\3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9、TIMP2\3\4则相应的下调,在SCC9细胞干扰MMP7后MMP3\10\13、TIMP1以及CDH1表达上调,而MMP9的表达则下调;15对标本中发现其中的13对(86.7%)癌旁组织中的TIMP1表达较癌组织高,而这13例癌组织全部同时高表达MMP1且其中有11例(73.3%)的癌组织同时高表达MMP7和低表达TIMP1,相关性分析发现MMP1与TIMP1在舌癌中呈现负相关性。
  第四部分:裸鼠舌癌正位高转移模型移植瘤中抑制MMP7表达,转移率随之降低
  结论:
  1.人舌癌标本RT-PCR及免疫组化实验发现MMP1\7在舌癌组织的表达高于癌旁组织;
  2.通过siRNA干扰技术和基因过表达技术,抑制和过表达MMP1\7基因后,舌癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力相应的降低和增强;
  3.MMP1可作为Notch信号通路和WNT信号通路的下游靶基因或通过降低TIMP1的表达促进舌癌的增殖、迁移、侵袭;MMP7可能与MMP1\3\9\10\13、TIMP1、E-cadherin共同作用参与舌癌的发生发展、迁移、侵袭;
  4.MMP7在裸鼠舌癌正位高转移模型移植瘤中促进舌癌细胞的转移。
  这说明MMP1\7基因可能在人舌鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭等生物学行为中起关键作用,因此MMP1\7可能是舌癌的早期分子诊断、预后评估和靶向治疗的关键分子,具有重要的研究价值。
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