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[硕士论文] 董艺
生物学、细胞生物学 河南大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  眼睛晶状体(lens)是一个高度透明的器官,它在整个生命过程中是不断生长的。其发育过程为上皮细胞不断分化为细长的纤维细胞,这些纤维细胞层层覆盖在同心层上,并且去除细胞核和其他的细胞器,称为终末分化细胞。晶状体纤维细胞中含有较高浓度的晶状体蛋白,这些晶状体蛋白在整个生命过程中必须保持可靠的稳定性和可溶性。晶状体分化异常和晶状体蛋白可溶性等的改变都会导致白内障的发生。白内障分为先天性白内障和老年性白内障。研究表明,热休克转录因子4(heat shock factor4,Hsf4)的基因突变会导致先天性常染色体显性白内障和隐性白内障的发生,但是由于Hsf4的功能异常而导致白内障发生的分子机制并不清楚。
  细胞为避免自身受到包括热休克和氧化应激等的外界环境的刺激,会产生大量高度保守的蛋白质,即热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)。这一反应过程称为热休克反应(heat shock response,HSR)。真核生物中,HSPs在转录水平上主要是受热休克转录因子(heat shock factors,HSFs)调控的。HSFs结合在HSPs基因启动子上的热休克元件(heat shock elements,HSEs)上启动HSPs的转录表达。HSEs是由多个保守的反向重复五核苷酸序列nGAAn组成的。热休克转录因子家族共有4个成员,分别为Hsf1、Hsf2、Hsf3和Hsf4。其中,Hsf4是晶状体中调控热休克反应的主要转录因子。敲除Hsf4的小鼠晶状体上皮细胞增殖异常,纤维细胞分化存在障碍,但其调控机制仍不清楚。本课题通过寻找Hsf4新的下游靶基因,并对其分子功能进行研究,基于此可以为我们深入理解Hsf4介导的晶状体发育过程提供新思路。
  目的:
  本课题以敲除和过表达 Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系 mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b为研究对象,通过转录组测序筛选Hsf4新的下游靶基因并对其分子机制进行探讨。
  方法:
  1.使用转录组测序技术,筛选出敲除和过表达Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b中差异表达的基因;
  2.使用实时荧光定量PCR技术,进一步验证转录组数据中差异表达的基因;
  3.通过双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀实验检测Hsf4与Aim-1启动子的结合情况;
  4.在敲除和过表达Hsf4b的小鼠晶状体上皮细胞系mlec-Hsf4b-/-、mlec-HA-Hsf4b中检测在43℃热激刺激下Aim-1的mRNA水平;
  5.在过表达Hsf4b的晶状体上皮细胞系mlec-HA-Hsf4b中敲低Aim-1后,检测Hsf4下游靶基因的表达;
  6.构建融合GFP的Aim-1不同结构域片段质粒,通过免疫荧光观察其在细胞中的亚定位;
  7.制备Aim-1的多克隆抗体及抗体的验证;
  8.使用实时荧光定量PCR和半定量PCR技术,检测Aim-1在小鼠不同组织中和在晶状体不同发育时期的表达;
  9.在野生型和敲除Hsf4的斑马鱼中,使用实时荧光定量PCR技术,检测zAim-1的表达情况。
  结果:
  1.转录组测序和实时荧光定量PCR筛选并验证Aim-1为Hsf4的新下游靶基因。
  2.Hsf4通过直接结合在Aim-1的启动子上调控其表达。
  3.Aim-1的表达不受热休克刺激的调控。
  4.敲低Aim-1导致Hsf4下游基因alphaB-crystallin的表达下降。
  5.Aim-1不同截短体在细胞内呈现不同的亚定位方式。
  6.制备的Aim-1抗体可以正确识别Aim-1蛋白。
  7.Aim-1主要在成年小鼠晶状体上皮细胞中表达。
  8.Aim-1a在敲除Hsf4的斑马鱼中表达量下降。
  结论:
  1.Hsf4通过直接结合在Aim-1启动子上调控其表达。
  2.Aim-1可能作为细胞骨架蛋白,通过与Hsf4其它下游基因如alphaB-crystallin相互作用,共同调控晶状体的发育。
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