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[硕士论文] 董美
生物化学与分子生物学 中国农业科学院 2018(学位年度)
摘要:伴随着测序技术的高速发展,下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)是目前核酸序列分析领域的主流测序技术,被广泛用于各类组学的研究。NGS是一种通量高、覆盖度广、快速有效的全基因组重测序手段,为生物技术作物分子特征解析提供了新的选择。分子特征是对生物技术作物在基因组上的改变及其产生的影响进行全面准确的描述。本研究以生物技术水稻作为实验材料,构建生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。主要研究内容与结果如下:
  1、建立了生物技术作物分子特征解析的NGS分析方法。以抗虫水稻科丰2号为研究材料,利用NGS技术初步建立生物技术作物分子特征解析的数据分析体系。分析结果与hiTAIL-PCR方法获得的科丰2号水稻分子特征结果一致,证明了该分析体系的可行性及可靠性。同时,该分析体系提供了一种较为简单的分子特征解析策略,即只需利用NGS解析插入位点,采用PCR扩增获得插入位点处的外源DNA全长序列。对于外源DNA片段相对较短的情况,这种方法简单易行、适用性强。
  2、获得了T1C-19和T2A-1两种水稻的分子特征信息,并进一步完善了基于NGS的分子特征解析体系。针对两种材料外源片段结构的复杂性,采用了个性化分析的方式,通过测序数据的挖掘分析、外源片段拷贝数预测,获得了两种材料的分子特征:T1C-19水稻的外源插入片段为2个拷贝的T-DNA同向串联重复,采用PCR验证了此结构;T2A-1水稻ubiquitin基因部分序列反向互补,采用PacBio三代测序验证了此结构。因此,该分析体系提供了另一种分子特征解析策略,即利用NGS获得分子特征信息,利用PCR扩增、三代测序等进行验证,该解析策略对解决外源DNA串联重复问题提供了参考方法。此外,对于单株作物获得的测序数据,直接可以对其纯合及杂合状态进行判定,为生物技术作物的遗传选育、品种鉴定提供服务。
  综上,本论文的研究结果显示,基于NGS技术的生物技术作物分子特征解析体系,克服了传统分析方法的不足,对于生物技术作物的审批、监管、追溯和标识等方面具有重要意义,此外,也为生物技术作物成分检测技术的发展提供技术支持。
摘要:近20年来,转基因作物的种植面积持续增加,转基因产品的流通量和流通速度呈迅速上升趋势.在不同国家与地区间,非转基因产品内出现低含量转基因成分的问题,即转基因成分低水平混杂日趋严重.以此问题为立脚点,比较全面的阐述了7个不同国家与地区(组织)的转基因成分低水平混杂的定义,分析了共同特点;总结了各国的现行政策与允许值的规定;概述了低水平混杂问题对进出口贸易方面产生的影响,旨为我国制定低水平混杂的相关政策及检测标准提供基础资料.
摘要:水稻作为最重要的粮食作物之一,其转基因安全性一直受到各国政府和人民的广泛关注.为了保障和引导公众对转基因水稻的正确而全面的认识,转基因生物安全检测工作必不可少.在目前的转基因检测工作中,核酸扩增技术是最为常用的检测方法.PCR技术是最成熟、应用最广泛的一种核酸扩增技术.然而,PCR技术对温控条件的极度依赖性制约它在田间的现场快速检测.本研究以转基因水稻PA1 10-15为对象,建立了重组酶聚合酶等温扩增及DNA试纸条联检的品系特异性检测方法,减少了对专用仪器的依赖,为快速现场转基因检测提供了新的解决方案.
摘要:依据全球转基因作物商业化的强势发展态势,转基因马铃薯的普遍商业化已呈大势所趋.马铃薯是世界第四大食用作物,仅次于水稻、小麦和玉米.目前,全球获批商业化种植的转基因马铃薯45种,主要涉及抗虫、抗病毒及品质改良等性状.转基因技术在给人们带来巨大经济效益的同时,也引起了人们的担忧,主要包括食品安全及环境安全问题等,由此转基因生物产品成分的检测及监管的重要性凸显.在转基因检测领域,标准质粒以容易获得、纯度高、成本低与稳定性好等优点逐渐被广泛应用.在调研了所有商业化的转基因马铃薯的重要信息的基础上,针对这些转基因马铃薯的主要外源基因类型,构建含有抗马铃薯甲虫cry3A基因、胭脂碱合成酶启动子P-nos基因、抗马铃薯Y病毒pvycp基因及内标准基因尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶PATA基因的多靶标质粒pBJGMM003.该质粒可用于大部分已批准转化体及部分在研转基因马铃薯的鉴定、检测与监管工作,解决了转基因马铃薯的阳性标准品匮乏等问题,保障了转基因马铃薯相关工作的顺利进行.
摘要:马铃薯是仅次于水稻、玉米、小麦的世界第四大食用作物.马铃薯主粮化已经成为时下热议的话题之一,其核心优势是产量高、耐瘠薄、消耗水资源少、易于加工等.在耕地和水资源相对紧缺的中国,这些优点无疑具有非常大的吸引力.目前,全球共批准商业化种植的转基因马铃薯40余种,主要性状为:抗病、抗虫和品质改良等,其中部分产品即将在我国申请转基因生物安全证书.详细阐述了转基因马铃薯主要性状的特点、国内外研究进展、审批情况与安全评价的政策,以期为我国政府部门的安全监管及检测标准制定提供参考.
摘要:通过3’端2次高效热不对称交互PCR (hiTAIL-PCR)和5’端4次hiTAIL-PCR及1次长链PCR获得了转基因抗虫棉材料06N-119的外源DNA插入片段的全序列.外源DNA插入片段全长11 578bp,由NptⅡ基因和Bt基因两个表达盒串联构成.插入位点处缺失75个碱基,未发生基因重组现象.根据3’端旁侧序列设计引物,特异性和灵敏度检测结果表明,建立的3’端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,最低检测限为每100ng模板量的0.05%,相当于11个靶标序列拷贝.本研究结果对转基因抗虫棉外源基因检测和生物安全评价具有重要意义.
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