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[硕士论文] 董婷婷
农业昆虫与害虫防治 安徽农业大学 2017(学位年度)
摘要:巴氏新小绥螨Neoseiulus barkeri是众多农业吸汁性害虫的重要捕食性天敌,因其捕食量高、繁殖速度快、发育历期短及防治效果好等优点在国内外捕食性天敌产品中应用面积较大,被公认为是最好的生物防治产品之一。巴氏新小绥螨成功越冬和次年春天发生是建立一个成功防治害虫的生物防治技术最基本也是最关键的问题。在农田中,巴氏新小绥螨主要在地表植被上越冬。自然条件下巴氏新小绥螨在冬季有很高的死亡率。许多科学家正致力于研究捕食螨产生滞育的临界光周期及相应的温度范围,以用于打破滞育或培育无滞育品系,适应冬天温室大棚的蔬菜生产或诱导滞育用于贮藏和运输,或为提供越冬场所,使其更好的越冬,减少死亡率提供参考。目前并没有关于巴氏新小绥螨滞育光照条件和温度的报道。鉴于此我们在实验室中评估了温度和光照对巴氏新小绥螨滞育诱导的影响。探究在不同温度和光照组合条件下,对巴氏新小绥螨的发育历期、滞育率、存活率以及耐饥性等参数的影响,筛选使巴氏新小绥螨滞育最合适的温度和光照组合条件。在此基础上,利用高通量测序技术,对其转录组进行深度测序;再筛选获得滞育相关基因的基础上,对巴氏新小绥螨卵黄原蛋白(NbVg1和NbVg2)及卵黄原蛋白受体(NbVgR)基因序列进行生物信息学分析分析,并利用qPCR方法对NbVg1、NbVg2和NbVgR在不同发育阶段的表达水平进行检测,明确其变化规律,以期从分子水平上初步阐明它们在巴氏新小绥螨滞育中的功能。由于卵黄蛋白的产生和摄取在所有卵生生物的繁殖中起重要作用,因此理解调节Vg和VgR的分子机制有助于掌控其繁殖规律,从而提高益螨的生物防治、控制害螨的发生。本研究所获得的主要研究成果如下:
  1.温度和光照对巴氏新小绥螨发育历期的影响:设置不同温度(14℃,16℃,18℃,20℃和22℃)和光周期(L∶D=0∶24,8∶16,16∶8和24∶0)组合,将巴氏新小绥螨从卵开始饲养至成螨。巴氏新小绥螨在14℃下,最久存活至若螨期,而在其它温度下,存在完整的发育历期。相同温度,随光照时长的增加,巴氏新小绥螨的发育历期先缩短,而后增加。相同光照,巴氏新小绥螨发育历期受温度影响较大,有显著差异,随温度升高而缩短,在16℃时长达33±0.35d,而在22℃缩短为9.3±0.35d。温度和光照是影响巴氏新小绥螨发育历期的重要生态因子。
  2.温度和光照对巴氏新小绥螨滞育率和存活率的影响:本研究中滞育现象被定义为雌成螨生殖的中止。低温和短光照可使巴氏新小绥螨出现很高的滞育率。实验结果表明,巴氏新小绥螨滞育现象的临界光周期为:温度18℃、光照19h。在16℃下,无论光照时长为多少,其雌成螨都会进入滞育状态,但存活率低约为10-13%;在18℃下,随着光照时间的增长,巴氏新小绥螨的滞育率逐渐降低,存活率逐渐升高,在L∶D=8∶16时,巴氏新小绥螨存活率较高约为75%,此时滞育率为100%;在20℃以上时,雌成螨存活率均高于80%,各处理间无显著差异;在20℃下,雌成螨的滞育率非常低,光照高于16h时无滞育现象发生;在22℃下,无论光照时长为多少,雌成螨不滞育。
  3.温度和光照对巴氏新小绥螨耐饥能力的影响:设置不同温度(14℃,16℃,18℃,20℃和22℃)和光周期(L∶D=0∶24,8∶16,16∶8和24∶0)组合,雌成螨间耐饥时间均存在显著性差异。巴氏新小绥螨雌成螨在18℃L∶D=8∶16情况下耐饥时间最长为21±0.29d。
  综合考虑滞育率、存活率和耐饥能力,在18℃L∶D=8∶16条件下,此时巴氏新小绥螨滞育率高、存活率高、耐饥时间最长,是使巴氏新小绥螨滞育的最适条件。
  4.滞育巴氏新小绥螨转录组分析:本文利用高通量分子测序平台分别对巴氏新小绥螨非滞育螨与滞育螨进行转录组测序,使用Trinity软件,通过无参测序数据将测序结果reads进行拼接,拼接获得巴氏新小绥螨的转录组Unigene,对Unigene进行功能注释和GO、KEGG等蛋白质功能分类和代谢途径分析。结果表明:滞育组获得48429018对raw data reads共7.31G。Trinity拼接结果获得了55013个转录本,23144个基因(序列总达25478066bp),在拼接得到的基因中基因长度平均为1100bp,最长基因长度为15791bp,N50为2114bp。表明拼接的gene质量较好。将拼接获得23144个gene使用blast方法进行基因功能注释后,其中有7863个注释到Swiss-Prot库,12625个注释到NR库,8480个注释到Pfam库,6225个注释到KEGG库,8004注释到KOG库,7192注释到GO库。注释到GO数据库中的7192个基因主要具有细胞分裂、转录、转录调控、翻译、信号转导、GTP结合、ATP结合等50多个功能。在KEGG数据库中获得注释的6225个基因,涉及新陈代谢、机体代谢、细胞过程、环境信息加工等通路。本研究对巴氏新小绥螨滞育螨进行转录组研究,获得大量的基因数据,为从基因和蛋白两个水平上更深层次研究滞育现象奠定了基础。
  5.巴氏新小绥螨Vg1、Vg2和VgR序列分析:以近缘植绥螨Vg、VgR基因作为参考序列,通过本地blast从巴氏新小绥螨转录组数据中筛选到2个巴氏新小绥螨卵黄原蛋白基因(NbVg1和NbVg2)和一个卵黄原蛋白受体基因(NbVgR)。巴氏新小绥螨NbVg1基因序列全长5623bp,开放阅读框长度5568bp,编码1856个aa,含有238个碱性aa,224个酸性aa,582个疏水aa,539个极性aa,13个糖基化位点(N-X-S或者N-X-T),1-16位aa为信号肽。预测蛋白质分子量约为212.52kDa,pI为8.57。结果分析发现,巴氏新小绥螨Vg1aa序列包含三个经典的保守区域Vitellogenin-N(31-730aa)、DUF1943(762-1040aa)和VWD(1482-1656aa),以及RXXR(RYAR)剪切位点、GL/ICG和DGXR基序。
  巴氏新小绥螨NbVg2基因序列全长5795bp,开放阅读框长度5532bp,编码1843个aa,含有235个碱性aa,209个酸性aa,556个疏水aa,550个极性aa,8个糖基化位点(N-X-S或者N-X-T),1-16位aa为信号肽。预测蛋白质分子量约为211.24kDa,pI为8.98。NbVg2aa序列的保守结构域是Vitellogenin-N(32-714aa),DUF1943结构域(755-1035aa)、VWD(1512-1684aa)以及R/KXXR切割位点、GL/ICG和DGXR基序。
  巴氏新小绥螨NbVgR基因序列全长5335bp,开放阅读框长度5109bp,编码1702个aa,含有198个碱性aa,255个酸性aa,450个疏水aa,508个极性aa,8个糖基化位点(N-X-S或者N-X-T),1-19位aa为信号肽。预测蛋白质分子量约为191.14kDa,pI为5.53。NbVgR的预测蛋白质序列揭示典型的LDLR家族受体特征。结果分析可知,巴氏新小绥螨VgR基因具有4个经典功能域:配体结合域、表皮生长因子前体同源域、跨膜结构域、胞质尾域。NbVgR有两个LBD,分别含有4个和8个class A重复域,表皮生长因子同源域有两个,都含有4个EGF-like重复域。
  6.巴氏新小绥螨NbVg1、NbVg2和NbVgR不同发育历期表达量分析:在不同发育历期(幼螨、若螨、产卵前期雌螨、产卵期雌螨、滞育雌螨和雄螨)中都能检测到NbVg1、NbVg2和NbVgR的转录表达水平。在整个巴氏新小绥螨的发育历期,幼螨期可检测到NbVg1、NbVg2较低转录水平,NbVg1、NbVg2和NbVgR的表达水平依次上升,发育为成螨期,转录水平迅速上升,对于这三个基因,成螨期的表达水平显著高于其它发育历期。其中滞育雌成螨NbVg1、NbVg2的表达水平最高,产卵期雌成螨的表达水平次之;NbVgR的表达水平在产卵前期表达水平最高,产卵期雌成螨的表达水平次之。另外,雄虫体内也检测到Vg和VgR的转录水平。分析表明,滞育雌成螨NbVg1、NbVg2的表达量高于其它时期,但NbVgR的表达水平明显低于产卵前期雌成螨和产卵期雌成螨。滞育雌成螨NbVgR表达水平显著低于非滞育雌成螨,导致卵母细胞没有办法摄取足够的卵黄原蛋白,致使雌成螨滞育,不能产卵。
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