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摘要:研究通过检测种鹅琼扩血清抗体水平和对应的被动免疫雏鹅琼扩血清抗体水平发现,当疫苗免疫剂量大于0.75 mL/只时,免疫4周时种鹅血清抗体水平及雏鹅血清抗体水平均较高.雏鹅血清抗体水平与雏鹅攻毒保护水平比较发现,雏鹅抗体(血清原液)阳性组和血清抗体效价达到1∶2及以上的雏鹅,攻毒后14日均未发生死亡,表明当雏鹅血清抗体阳性即可完全保护雏鹅,即雏鹅血清抗体水平与攻毒保护评价方法具有较高的正相关性.因此,本研究结果表明采用血清学效力检验可以替代传统动物攻毒试验方法,可作为小鹅瘟灭活疫苗效力检验的指标....
摘要:运用不同佐剂,并配合不同剂型,制备猪圆环病毒2型(PCV2)灭活疫苗(YZ株),然后评价各疫苗对仔猪的免疫效力.制备的灭活疫苗包括:用10号白油制备油包水(W/O)剂型疫苗;用MontanideTM ISA 206 VG佐剂制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗;分别用MontanideTMISA 15A VG和ISA 35 VG佐剂,制备水包油剂型(O/W)剂型疫苗;用MontanideTM IMS 251C VG佐剂,制备水(W)剂型疫苗.除白油组外,其余4组疫苗安全性较好.5组疫苗免疫效力试验表明,ISA 206 VG (W/O/W)疫苗组首免后2周和3周PCV-2荧光抗体水平显著高于白油(W/O)和IMS 251C VG (W)疫苗组(P<0.05);攻毒后猪血清中病毒PCR检测,ISA 206 VG (W/O/W)疫苗组14 d均为阴性,其他免疫组21~28 d转为阴性;猪淋巴结免疫组化检测,ISA 206 VG (W/O/W)、ISA 15A VG (O/W)疫苗组均未出现PCV-2阳性,且该两组中仔猪均未出现连续2d以上的高热症状.以上结果表明,ISA 206 VG (W/O/W) PCV2灭活疫苗(YZ株)对仔猪具有较好的免疫保护效力,可进行后续的临床扩大试验....
[期刊论文] 范娟 钱钟 刘秀梵
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北大核心
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摘要:从江苏省某发病鹅场中分离到1株疑似小鹅瘟病毒,纯化后病毒通过电镜观察可见直径约20~25 nm的病毒粒子;琼脂扩散试验结果显示该毒株与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,与其他阳性血清未发生反应;人工感染雏鹅,可致发病和死亡,通过基因序列测定及遗传进化分析进一步确认该分离株为小鹅瘟病毒.该流行株与当前市售的小鹅瘟弱毒活疫苗具有较大的遗传差异,可为新疫苗的开发提供基础....
摘要:猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是近年来发现的一种较难控制的传染病.该疾病主要侵害哺乳仔猪、育肥猪及怀孕母猪[1],其特征性临床症状为患猪体质不良、皮肤苍白,引起的疫病包括仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等.PCV-2感染产生的免疫抑制极易引发其他病原混合感染或继发感染[1-2].目前,猪圆环病毒病在我国已普遍发生,表现为流行范围广、阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点,给我国养猪业造成严重的经济损失[3].目前,疫苗接种被认为是防控该病最有效的手段之一....
[博士论文] 范娟
兽医 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:小鹅瘟是导致雏鹅死亡的常见疾病之一,可造成巨大经济损失,严重危害养鹅业的发展。现有弱毒活疫苗和小鹅瘟抗体的广泛应用,在我国小鹅瘟疫病防控过程中发挥了巨大的作用。但活毒疫苗存在毒力返强的潜在危害,从而限制了其生产应用,因此研究小鹅瘟灭活疫苗显得尤为重要。本研究对小鹅瘟分离毒株的生物学特性进行了系统研究,筛选出免疫原性好、繁殖滴度高的小鹅瘟野毒株作为灭活疫苗候选株,并开展了生产工艺、乳化工艺和免疫效力研究工作,以期制备出安全、高效的小鹅瘟灭活疫苗,为我国小鹅瘟疫病的防控和净化提供有力工具。
  1、小鹅瘟病毒疫苗候选株的筛选
  为了研制与当前小鹅瘟流行株匹配的疫苗,本研究对从2009~2011年江苏省养鹅地区疑似小鹅瘟的临床样品中共分离了5株鹅细小病毒(GPV),同时对分离株进行VP3基因测序并绘制遗传进化树,序列分析结果表明GPV分离株与国内大部分分离株属于同一分支,明显不同于国内疫苗株SY61和台湾主要分支。对获得的毒株经有限稀释法纯化,并对纯化后的病毒进行繁殖性能、毒力、特异性及免疫原性等进行了测定,5株病毒均属于强毒株,其中Gosling plague virus/taizhou/10(TZ10)株病毒含量最高(F10代:1050ELD50/0.2ml以上),且其灭活抗原免疫鹅4周后的抗体水平最高,因此确定以TZ10株作为小鹅瘟疫苗候选株。
  按照农业部颁发的《兽用生物制品(毒、虫)种种子批建立实验技术指导原则》各项要求,对纯化后的TZ10株F0代毒在鹅胚中连续传至30代,并分别对不同代次种毒进行了AGP、鹅胚半数致死量(ELD50)测定、免疫原性、特异性实验及纯净性检验,建立了符合规定的小鹅瘟病毒TZ10株的基础种子批(F16~F20种毒)、规定了生产用最高限制代次(F25)。
  2、小鹅瘟灭活疫苗生产工艺研究
  疫苗生产过程中,抗原的生产工艺决定了疫苗质量及生产成本,抗原的完全灭活和疫苗的乳化工艺分别是关系到疫苗安全、有效性和疫苗质量的关键步骤。本研究选取前期种子批F25代次GPV尿囊液,进行最佳鹅胚接种剂量与最佳鹅胚接种日龄的试验,从鹅胚死亡数统计、抗原收获量统计、病毒含量测定三方面进行比较,分别确定生产过程中最佳病毒稀释比例、接毒剂量、鹅胚日龄为:种毒用灭菌生理盐水进行1∶100倍稀释,0.2ml/胚剂量尿囊腔途径接种11日龄非免鹅胚最佳。根据接种后不同时间鹅胚死亡数、抗原收获量、死亡鹅胚情况和病毒含量测定数据确定种毒最佳培养时间为接毒后48~120小时,收获死亡鹅胚尿囊液;抗原最佳培养时间为接毒后48~144小时,收获死亡鹅胚尿囊液及鹅胚。为了确定抗原灭活的最佳方法,对甲醛溶液的浓度、灭活时间进行了研究,结果表明:采用甲醛溶液作为灭活剂,灭活剂终浓度为0.2%,37℃灭活48小时,可以完全灭活小鹅瘟病毒TZ10株。乳化工艺研究证实:取小鹅瘟病毒TZ10株灭活抗原,按每96份抗原加4份灭菌吐温-80比例加吐温-80,充分溶解混匀,制成水相;94份注射用白油加6份司盘-80及1份硬脂酸铝,加热溶解至透明灭菌,制成油相;水相与油相的最佳配比为1∶3,二次乳化的剪切速率在3000~4000r/min,乳化过程温度控制在25℃以下,可获得最佳乳化效果。
  3、小鹅瘟灭活疫苗的安全性评价
  按照确定的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)生产工艺,在实验室试制了3批灭活疫苗。将试制的3批小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)通过疫苗单剂量、单剂量重复及双倍剂量免疫3~5日龄、1月龄鹅、7月龄开产种鹅、9月龄产蛋种鹅进行安全性评价,结果表明:所有免疫鹅精神状态、采食、饮水正常,无全身不良反应。接种部位无肿胀,免疫21日后,单剂量重复和双倍剂量接种的实验组中,有少量疫苗颗粒未吸收现象;除双倍剂量接种组个别鹅注射部位肌肉有轻微潮红外,其余各免疫组免疫鹅注射部位无异常变化。免疫21日后,免疫组与对照组鹅平均增重无显著差异。疫苗注射后1周内产蛋鹅产蛋数较对照组少2~3枚,之后恢复正常,且种蛋孵化率无差异。表明研制的小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)对产蛋鹅安全,雏鹅接种后未出现任何临床症状。
  4、小鹅瘟灭活疫苗的效力评价
  通过对3批试制疫苗的免疫效力试验,发现小鹅瘟疫苗免疫种鹅产生的GPV血清琼扩抗体水平与雏鹅被动免疫GPV琼扩抗体水平、攻毒保护率呈正相关;对种鹅血清GPV琼扩抗体效价与对应雏鹅攻毒保护结果相关性分析表明,当种鹅血清抗体效价为1∶2时,雏鹅血清被动免疫保护率为92.3%;当种鹅血清抗体效价不低于1∶4时,雏鹅被动免疫保护率达到100%。考虑到临床饲养环境及鹅群健康状况的不确定性,规定疫苗的效力检验标准为:7~8月龄健康阴性鹅,胸部肌肉注射疫苗,1.0ml/只,4周后其血清GPV琼扩抗体效价几何平均值应不低于1∶8。
  最小免疫剂量实验结果表明,试制的3批疫苗以不低于0.5ml/只剂量免疫7~8月龄产蛋种鹅,免疫后种蛋孵化的雏鹅90%以上可以抵抗GPV强毒的攻击。根据3批试制疫苗制苗抗原灭活前的病毒含量及最小免疫剂量试验结果,考虑到临床实际情况的复杂性,为保证雏鹅获得确实的被动保护,规定制苗用半成品抗原的病毒含量应≥1055ELD50/0.2ml、推荐免疫剂量为1.0ml/只。
  根据3批试制疫苗免疫持续期的种鹅和雏鹅的血清AGP抗体效价及所产种蛋孵化雏鹅的攻毒保护试验结果,确定种鹅开产前免疫2次,1ml/次,其免疫持续期为5个月;推荐免疫程序为:种鹅开产前5周首免,胸部肌肉注射,1.0ml/只,3周后以相同剂量、途径加强免疫1次。该免疫程序可基本保证种鹅在6个月产蛋期内,雏鹅获得有效母源抗体抵抗GPV感染。
  因健康阴性产蛋种鹅的来源和质量不够稳定,其作为效检用动物时,难以保证检验结果的稳定性及可重复性。为此本研究对疫苗免疫SPF鸡后血清抗体效价及特异性进行了分析,以探讨其作为小鹅瘟疫苗效检替代动物的可行性。3批小鹅瘟灭活疫苗以不同剂量免疫21日龄SPF鸡,抗体检测结果显示同一剂量不同时间点检测的SPF鸡血清AGP抗体效价基本一致,表明SPF鸡对疫苗可产生稳定的免疫抗体反应。将SPF鸡免疫后阳性血清与小鹅瘟病毒进行中和反应结果表明,SPF鸡免疫小鹅瘟灭活疫苗后产生的抗体具有特异性;抗体效价随免疫剂量和时间的变化规律与7~8月龄健康阴性种鹅免疫后血清AGP抗体效价的变化规律一致,证明免疫SPF鸡后测定血清AGP抗体效价方法作为小鹅瘟灭活疫苗的效检方法是可行的。
  根据疫苗免疫SPF鸡和种鹅的中和抗体效价与AGP抗体效价相关性分析,当种鹅AGP抗体效价在1∶8时,中和抗体效价为2.87log10,对应的SPF鸡血清AGP抗体效价为1∶16;根据免疫剂量与抗体产生的正相关关系,及实验动物对疫苗的吸收情况,确定21日龄SPF鸡作为小鹅瘟灭活疫苗(TZ10株)效力检验替代动物的检验标准为:21日龄SPF鸡,颈部皮下注射,0.25ml/只,免后4周小鹅瘟AGP抗体效价的几何平均值应不低于1∶18。
摘要:在灭活疫苗制造过程中,疫苗的乳化工艺是保证疫苗品质的重要环节,也是影响疫苗稳定性的关键步骤之一[1-3].试验以<中国兽用生物制品制造与检验规程>(2000年版)的乳化方法为基础,参照禽用灭活疫苗常规乳化工艺对抗原的乳化方法进行了研究,并确定了制造鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗的最佳乳化工艺,为进一步提高疫苗的稳定性、免疫效力、免疫保护期和保存期奠定了基础....
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