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[期刊论文] 苏茹月 丁萍 商巾杰
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CSTPCD 北大核心
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摘要:ATP是由ATP合酶复合体催化合成的,在线粒体呼吸过程中起着重要作用.旨在研究粟酒裂殖酵母中Atp11 (SPAC3A12.12)在线粒体中的功能.利用同源重组的方法构建Δatp11突变体,观察Δatp11缺失菌在以甘油为唯一碳源的非发酵培养基上的表型;通过生物信息学分析发现Atp11的N端含有一段由24个氨基酸残基组成的线粒体定位序列(MTS),为确定Atp11在细胞内的定位,在Atp11的C端添加一个GFP标签,观察绿色荧光在细胞内的位置;运用Western blotting检测atp11的缺失对线粒体基因组编码蛋白稳态性的影响.研究结果表明,Δatp11突变体在非发酵培养基上表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;GFP绿色荧光定位实验结果证实了Atp11定位于线粒体中;Western blotting 检测结果显示atp11的缺失导致Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白的表达量显著降低.综上所述,粟酒裂殖酵母Atp11定位于线粒体且是线粒体呼吸链正常发挥功能所必须的....
[硕士论文] 苏茹月
生物学;微生物学 南京师范大学 2018(学位年度)
摘要:线粒体是普遍存在于真核生物的一种细胞器,它不仅与ATP的合成有关,而且还参与细胞物质代谢以及细胞凋亡等生理过程。线粒体疾病的产生大多数是由于线粒体功能受损引起的,因此线粒体与人类健康有着密切的关联。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)在进化上与人类更为接近,在研究线粒体功能方面是一种优良的模式生物,因此线粒体也越来越受到研究者的青睐与关注。
  粟酒裂殖酵母线粒体是一种半自主型细胞器,其自身基因组能够编码25个tRNAs,2个rRNA,1个RNase P RNA,核糖体蛋白(Var1)和7个线粒体呼吸链复合体亚基包括复合体Ⅲ的Cob1亚基,复合体Ⅳ的3个大亚基(Cox1,Cox2,Cox3),复合体Ⅴ的3个亚基(Atp6,Atp8,Atp9)。粟酒裂殖酵母线粒体蛋白的翻译过程包括起始、延伸、终止,此过程需要多种蛋白因子共同参与调控。Mti2和Mti3是预测与线粒体翻译起始有关的蛋白,Mti2的发现是通过前期免疫共沉淀实验中Ppr10与Mti2有相互作用,因此,本文主要探究粟酒裂殖酵母中Mti2,Mti3的主要功能。
  首先构建mti2,mti3基因敲除菌,发现mti2基因敲除菌在以甘油为唯一碳源的非发酵型培养基上表现出生长缺陷,而mti3基因的缺失不表现出生长缺陷,由此推测mti2基因的缺失可能导致线粒体呼吸链功能受损。其次,通过改变培养温度以及培养时间,发现△mti2菌株在稳定期后期细胞出现了一定的死亡并且△mti2菌株在37℃下生长受到更加严重的抑制,说明△mti2菌株功能受到了影响。然后,将芽殖酵母线粒体翻译起始因子IFM1回补到△mti2菌株中,发现mti2基因敲除菌在非发酵型培养基上能够正常生长,这说明IFM1蛋白与Mti2蛋白具有功能保守性。实时荧光定量PCR发现mti2基因的缺失影响了线粒体基因组编码的mRNA水平以及稳定期后期线粒体基因组的拷贝数。最后,通过BN-PAGE和Western blot实验发现mti2基因的缺失严重影响了线粒体呼吸链上各复合体及超复合体的组装。这些实验结果表明,Mti2是裂殖酵母线粒体翻译起始因子,并基于△mti2△mti3双敲菌株在非发酵型培养基上出现了更加严重的生长缺陷,因此推测Mti3蛋白很有可能协助Mti2蛋白完成线粒体蛋白的翻译起始功能,这些结果对了解线粒体的转录调控与功能有很重要的意义。
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