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[硕士论文] 苏晓霄
药物分析学 西南大学 2017(学位年度)
摘要:革兰氏阳性菌是一类威胁人类和动物健康最主要的致病菌。其中金黄色葡萄球菌可以造成食物中毒,败血症,脓毒症等严重危害;蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌同样也可以引起食物中毒和严重感染;变异链球菌是人类龋病的主要致病微生物,常见于牙菌斑中。鉴于革兰氏阳性菌对人类,动物的危害,发展灵敏,简单,即时的革兰氏阳性致病菌的检测新方法对临床诊断具有重要意义。化学发光分析法是一种依据于体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,进而确定待测物含量的一种痕量分析方法。而生物发光是一种生物体系中发生的化学发光,它在化学反应过程中会产生可见光。ATP发光是一种最常见的生物发光,它的反应机理是荧光素酶在荧光素和氧气的存在下,催化消耗ATP而产生较强的光辐射信号。
  本研究主要内容包括:⑴基于万古霉素的亲和作用建立了一种利用生物发光法检测革兰氏阳性菌活菌总量的新型分析策略。本项工作中,万古霉素作为一种新型分子识别试剂,修饰在羧基化的磁性颗粒上用于从样品基质中快速分离和富集革兰氏阳性菌。随后裂解捕获的细菌,使三磷酸腺苷从细菌细胞内释放,进而通过采集生物发光反应产生的发光信号来定量检测革兰氏阳性菌的活菌总量。实验结果表明,四种革兰氏阳性菌,包括金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、蜡样芽孢杆菌、变异链球菌在1×102-1×107 CFU ml-1范围内均与生物发光强度呈现出良好的线性关系,其检测限均为33 CFU mL-1(信噪比=3)。由于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死菌对该方法的检测几乎没有干扰,该策略用于检测活的革兰氏阳性菌表现出良好的特异性。同时该策略可成功地应用于食品和药物样品的加标回收实验,所得回收率范围为72%-120%。该策略具有灵敏度高,成本低,特异性较高,检测时间短等优点,并且在药品质量控制、医疗卫生、食品安全等方面有较好的应用潜能。⑵基于化学发光分析方法建立了一种利用双位点分子识别模式检测变异链球菌的新型分析策略。在这项工作中,替考拉宁作为一种新型的分子识别试剂,修饰在羧基化的磁性颗粒上用于识别和捕获变异链球菌。为了进一步提高该策略的特异性,利用大鼠免疫球蛋白G2a能够特异性结合变异链球菌细胞壁上G蛋白这一特点,我们在大鼠免疫球蛋白 G2a上标记辣根过氧化物酶作为第二种分子识别试剂以及信号探针,然后通过采集磁性颗粒捕获到的变异链球菌的化学发光信号来定量检测样品基质中的变异链球菌。结果表明,变异链球菌在1×102-1×106 CFU ml-1范围内与化学发光强度有着良好的线性关系,检测限为33 CFU mL-1(信噪比=3)。该策略可成功应用于食品、药物和生物样品的加标回收实验,所得回收率在83%-110%之间。该策略具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点,可以为复杂样品中病原菌的快速检测提供一条新的途径。
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