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[硕士论文] 艾迪那·阿达依
口腔医学 天津医科大学 2017(学位年度)
摘要:背景:
  人类疾病中,感染性疾病是导致生命死亡的主要疾病之一,其主要病原体是微生物。在现已发现的人类微生物感染性疾病中,研究发现有75%感染的发生与微生物生物膜形成有关,且微生物生物膜是造成口腔常见疾病的关键病因,例如:龋齿,牙周疾病,牙髓病,根尖周病和种植体周围炎等。根据世界卫生组织的调查显示,在众多工业化国家中,有60%-90%的学龄儿童和成人患龋率较高。此外,在全世界中有牙周病症状的成年人非常普遍,约有5%-20%的成人和2%的青少年患病成高发状态。研究表明,细菌是导致口腔生物膜疾病的首要原因。细菌生物膜的形成是一个多步骤且复杂的过程。随着初期附着菌的吸附,牙菌斑开始逐渐形成直至成熟,形成一个高度结构化且复杂的群体。有文献报道清洁牙面后的最初4小时内,粘附到牙齿表面的细菌有60%—90%为口链球菌(Streptococcus oralis,S.oralis),血链球菌(Streptococcus sanguinis,S. sanguinis),格登链球菌(Streptococcus gordonii, S. gordonii)。本研究采用人体β防御素(human beta-defensins hBDs)抑菌,根据现有研究基础及参考文献,为了最大限度的保留人体β防御素3(“human beta-defensins3,hBD3”)的抑菌作用和生物稳定性,本课题合成hBD3的3条短肽hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3,以抑制生物膜初期附着菌生长,进而抑制口腔生物膜的形成。本研究避免了抗菌肽刺激机体后产生的特异性免疫反应,防止了在高渗环境下抗菌肽失去抑菌活性,克服了药物抗菌所诱导的耐药性,为生成嵌合多肽,治疗相关感染性疾病开辟了新途径。
  目的:
  hBD3为“天然抗生素”中的一员,在口腔中作为第一道防御屏障,能够治疗革兰氏阳性菌(Gram-positive,G+)和革兰氏阴性菌(Gram-negative,G-)造成的感染性疾病。链球菌是牙菌斑形成过程中的初期附着菌,同时也是造成口腔牙菌斑疾病的重要原因。本论文设计合成hBD3的N端起始的三条短肽hBD3-1, hBD3-2,hBD3-3,评估hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3对口腔链球菌的抑菌作用。方法:
  本研究中设计合成hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3,检测hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3对S.oralis,S. sanguinis和S. gordonii生物活性的抑制作用。通过最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration MIC),最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration MBC)和生物膜形成实验测试hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3对不同状态下链球菌生长的抑菌作用。拉曼光谱(Raman spectroscopy)和圆二色光谱(Circular Dichroism spectroscopy)研究hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3二级结构。通过激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy CLSM)和电子扫描显微镜(Scanning Electron Microscopy SEM)观察链球菌细胞形态。
  结果:
  hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3对链球菌的生长均具有抑制性,其中浮游状态下的S.oralis和S. sanguinis生物膜对hBD3-3的药物敏感性最强(P<0.05)。Raman spectroscopy实验结果表明hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3的二级结构中均具有酰胺Ⅰ和β折叠。但是在 hBD3-2, hBD3-3的二级结构中未发现酪氨酸。CD spectroscopy实验结果表明在口腔环境中hBD3-1,hBD3-2,hBD3-3抑菌活性保持稳定,不会因为温度的变化影响抑菌作用,且不受二硫键的影响。通过CLSM镜下观察染色的链球菌生物膜发现作用于hBD3-3的细菌生物膜的凋亡细胞染色比例要多于对照组。SEM镜下观察到hBD3-3对链球菌生物膜生物量的减少和细菌形态的破坏。
  结论:
  hBD3-3作为hBD345氨基酸序列中的一段短肽,能够有效抑制初期附着菌的生长,进而抑制口腔生物膜的形成,最终预防和降低口腔生物膜感染性疾病,维持口腔健康。
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