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[博士论文] 胡芳馨
分析化学 西南大学 2015(学位年度)
摘要:细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单元,其中存在一些具有特殊生理功能的活性小分子物质,如活性氮分子(RNS)和活性氧分子(ROS)等。它们是一类含氮或含氧自由基或分子,对于脂类、蛋白质以及核酸分子均有较高反应活性。基于细胞内RNS和ROS的浓度,它们既可以充当“朋友”亦可以是“敌人”,其浓度处于正常值时,参与细胞信号传导、控制细胞的增殖、分化与凋亡、促进多种因子细胞生物学效应的启动;而当平衡打破,其浓度升高时,则会引起氧化应激、导致细胞膜脂质过氧化、引起DNA的氧化损伤、介导细胞内蛋白质的变性等,进一步造成细胞癌变和死亡、肿瘤发生和发展、甚至心血管疾病等。鉴于此,原位实时定量检测活细胞释放RNS和ROS,不仅能帮助我们从分子水平理解它们介导生理过程,而且有助于我们揭示其引发相关疾病的机制,从而进行疾病早期检测、预防及选择适当的治疗方法。然而,RNS和ROS的实时灵敏检测极具挑战性,其释放的量很少且半衰期短、活性高、易与生物环境中其他分子发生反应。因此,构建有效、灵敏的检测平台及生物相容性良好的细胞生长平台是RNS和ROS原位检测的关键。电化学方法操作简便、特异性强、响应快、灵敏度高且成本低,因而成为细胞释放活性小分子检测的常用技术手段。碳材料如碳纳米管、石墨烯等被广泛应用于电化学平台的建设及细胞相关实验的研究。
  本论文设计并合成了功能纳米材料协同催化的仿生酶,提高了检测稳定性和选择性,并构筑了具有生物兼容性和特异催化活性的纳米界面,实现了高灵敏度活细胞释放RNS和ROS小分子的实时动态检测,并深入探讨了其催化机理。在此基础上,进一步构建了活细胞直接生长的2D及3D自支撑传感膜,并系统研究了该传感膜的细胞粘附及电化学性能,结果表明将细胞直接生长在传感膜上可以大大提高检测的灵敏度。主要内容及结果归纳如下:
  1. NO是众多癌细胞病变过程中释放的一种信号传导分子。然而,由于NO极易扩散、浓度低、寿命短,实现 NO的实时检测仍是极大的挑战。本工作通过水热法合成了形貌可控的还原氧化石墨烯-二氧化铈纳米复合物(rGO-CeO2),并用它来构建高灵敏的NO实时检测传感器。rGO-CeO2纳米复合物中 CeO2的晶体形貌对rGO-CeO2传感器的性能有重要影响。其中,六边形的CeO2纳米晶体催化性能最佳,达到了最高的灵敏度(1676.06 mA/(cm2·mol/L)),较宽的线性范围(18.0 nmol/L到5.6μmol/L)及低的检测限(9.6 nmol/L)。这一最优性能主要归功于特殊形貌的CeO2良好的催化性能及rGO优良的导电性和高的比表面积。本工作展示了一个通用的方法通过有效调控复合物中单组分的优势来合成具有超强协同作用的传感平台,同时也为快速实时检测活细胞释放NO提供了极大的可能性。
  2. O2-是细胞释放的一种ROS小分子,正常情况下对细胞的多种生命活动起着重要的介导作用,但是当其含量超过正常水平时,会打破体内氧化还原平衡,导致氧化应激,进而损坏细胞、引发病变,因此,实时定量检测细胞释放的O2-对于疾病的诊断及预防非常重要。本工作中,采用DNA诱导合成的磷酸锰梭状材料(DNA@Mn3(PO4)2)作为O2-生物模拟酶功能化修饰氧化石墨烯(GO)。该材料制备的特异性生物模拟酶传感器表现出较高的灵敏度(1556.97 mA/(cm2·mol/L))、较宽的检测范围(6.5 nmol/L到8.85μmol/L)和极低的检测限(2.1 nmol/L)。此外, DNA@Mn3(PO4)2/GO传感器实现了原位实时检测药物刺激下人类皮肤癌细胞和正常细胞释放的O2-,表现出良好的实时定量检测性能。由实验结果可得,癌细胞释放的O2-量为正常细胞的5倍(平均值)。
  3.原位实时检测ROS对于研究各种基础的细胞生理过程极其重要,但是目前报道的工作大多检测的是生长在培养基中细胞释放的ROS,其半衰期短、浓度低、活性高,造成测试的灵敏度和选择性都受到极大的限制。本工作中,我们提出了一种新的方法将活细胞直接生长在 DNA/Mn3(PO4)2修饰的垂直生长碳纳米管(VACNT)阵列上来构建柔性支撑杂化膜,其中DNA/Mn3(PO4)作为一种高效的O2-仿生歧化酶,表现出很高的电催化活性;VACNT具有优异的导电性和生物相容性,提供了快速电子转移载体和细胞生长平台,此外细胞直接生长在传感膜表面大大缩短了检测底物与活性位点之间的扩散距离,从而实现了高灵敏实时检测癌细胞在药物刺激下释放的O2-。与检测培养基中细胞释放O2-相比,检测灵敏度增加了6倍多,证明活细胞分泌的O2-没有经过扩散过程或经过很短的扩散距离,直接被生物膜捕获并催化。这一设计缩短了细胞释放的检测目标物与传感器之间的距离,避免了在此扩散过程中,大部分目标物由于活性高、寿命短而衰减的可能性,大大提高了传感器的灵敏度。
  4.众所周知,细胞在生物体内的实时生长环境是三维(3D)的,为了研究人类的生理活动机理,我们必须在体外培养细胞,要想得到更准确的研究数据,创造体外3D细胞培养环境极其重要。然而,现在报道的大部分工作均是基于2D平台。本工作中,我们创造了一个3D细胞贴附/生长环境,首先通过化学气相沉积法制备3D泡沫石墨烯(GF),然后采用绿色、简易的基底增强-化学沉积法在GF上修饰Pt纳米颗粒。该Pt@GF复合物表现出良好的多功能性,其中3D大孔GF表现出了拟人体实时生物环境,为细胞的生长提供了良好的贴附/生长支架以利于后续细胞释放O2-的高灵敏实时检测,此外,Pt纳米颗粒对O2-表现出了超强的电催化活性。荧光显微镜和扫描电子显微镜的观察结果表明,细胞在3D Pt@GF复合物上的生长状态、表达、贴附及代谢活动相较其在2D Pt@石墨烯片(Pt@GS)复合物上,均表现出更优的性能。与生长在2D Pt@GS上的细胞相比,本文提出的3D装置检测细胞释放O2-灵敏度提高了1.4倍,这可能归功于电子可以在O2-和GCE表面直接沿着石墨烯骨架传递、迁移,形成一条电子传递捷径,极大地加快了电子转移速率。然而,对于GS来说,电子在其间的传递必须经过较长距离到达石墨烯层的缺陷边缘穿过石墨烯层到达GCE表面。因此,3D Pt@GF复合物更有希望应用于活细胞相关的研究,如药物递送、组织工程学及再生医学等。
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