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[专利] 发明专利 CN201910864362.8
集美大学 2019-12-31
摘要:本发明提供了一种拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 4的突变体及其应用,所述突变体是将拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 4氨基酸序列的第70位突变成丙氨酸,所述拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据本发明的拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 4的突变体,通过重叠延伸PCR的手段对野生型Scy p 4基因进行了定点突变,将突变的基因与表达载体重组后转入宿主细胞中,成功构建具有低致敏性的Scy p 4基因的突变体;与野生型变应原相比,该突变体的IgE结合活性降低,可用于免疫治疗或免疫预防,可减少免疫治疗中的副作用,提高治疗的安全指数。
[专利] 发明专利 CN201910818141.7
集美大学 2020-01-14
摘要:本发明提供了一种葡萄牙牡蛎致敏蛋白及其应用,该致敏蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。根据本发明的葡萄牙牡蛎致敏蛋白的编码基因,其克隆入原核表达载体,构建重组表达质粒,再转入宿主菌并诱导表达,可获得重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP,利用该重组葡萄牙牡蛎致敏蛋白rSCP与贝类过敏患者血清进行IgE结合能力的测定,可为过敏症状的临床诊断及致敏原详细筛查提供参考依据,使得针对SCP的过敏性疾病的防控和治疗及时准确。
[专利] 发明专利 CN201810721693.1
集美大学 2018-12-07
摘要:一种章鱼丸的加工方法,涉及章鱼丸。原料前处理;漆酶改性;将得到的章鱼丸放入开水中,至章鱼丸漂起,将章鱼丸立即放入冷水中冷却后塑封,成品于‑30℃速冻后保存。通过漆酶改性处理,显著降低甚至消减章鱼肌肉的致敏性,经煮制过程后,通过简单加工即可获得低致敏性的章鱼丸。方法具有工艺简单、操作方便等特点,所得产品味道鲜,通过Dot blot免疫印迹分析加工前后章鱼主要过敏原的特异性IgE结合能力,验证所制作的章鱼丸致敏性明显消减。
[硕士论文] 胡梦君
生物学 集美大学 2018(学位年度)
摘要:蟹类作为一种营养价值高、肉质鲜的水产品,广受消费者喜爱,但是随之引起的食物过敏发病率持续上升。本文以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象,对青蟹中的新型过敏原肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)进行重组表达,对其抗原表位进行定位分析,探讨酶法交联反应、拉德反应对重组SCP(rSCP)致敏性的影响,以期为过敏性疾病诊断和低致敏性食品开发提供理论依据。
  本研究首先从拟穴青蟹肌肉中纯化出分子量约20kDa的SCP,通过免疫新西兰大白兔获得兔抗青蟹SCP血清,纯化得到兔抗SCP-IgG多克隆抗体。构建表达载体pET-22b-SCP,在E.coli Rossetta菌株中诱导表达获得可溶性的rSCP。圆二色谱、抑制性ELISA、免疫杂交分析结果显示,rSCP与天然SCP(nSCP)均呈典型的α/β蛋白特征,在IgE结合活性方面能够相互抑制,在高温(60℃~100℃)、弱酸(pH2.0~5.0)、强碱(pH10.0~11.0)条件下均易发生聚合,表现出结构、免疫结合能力及理化特性的一致性。体内动物及体外细胞试验结果显示,rSCP使BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞Th2型相关细胞因子IL-4和IL-13分别升高至300pg/mL、250pg/mL,也能够上调蟹类过敏患者嗜碱性粒细胞的表面分子CD63和CD203c水平。不同甲壳类动物的SCP与rSCP可以竞争结合虾蟹类过敏患者血清中IgE,且rSCP的抑制效果最强,提示rSCP可以代替天然蛋白用于过敏原组分诊断。
  其次,采用嗜碱性粒细胞活化试验确定SCP过敏患者,并用鼠抗人anti-IgE富SCP过敏患者血清中的IgE;以兔抗SCP-IgG多克隆抗体和SCP过敏患者血清IgE为靶蛋白,经过噬菌体展示技术亲和淘选共定位得到3个IgG抗原表位和6个IgE抗原表位,值得指出的是IgG表位的氨基酸组成均在IgE表位中存在。这些抗原表位主要分布在SCP的一级序列保守区域、二级结构的α-螺旋末端和无规则卷曲柔性区域、蛋白质空间结构的表面;其中Epitope1(N37T38L39I38E41G42R43Y51N54T112)为IgE与IgG所共同识别的抗原表位,在淘选到的克隆子序列中重复性最高,推测为SCP的关键表位。
  最后,通过分析食品加工处理对rSCP致敏性的影响,发现酪氨酸酶作用下的rSCP酶法交联反应产物(CL-SCP)、木糖与rSCP发生拉德反应的产物(MR-SCP)致敏性均降低。圆二色谱分析显示,MR-SCP、CL-SCP的α螺旋含量分别降低至16.4%和16.2%,β折叠的含量分别升高至32.2%和31.3%。与rSCP相比,MR-SCP、CL-SCP激活患者嗜碱性粒细胞表达的CD63和CD203c比例下降。结合SCP抗原表位分析认为,酪氨酸酶可以催化交联SCP蛋白表位区域的酪氨酸残基,而拉德反应可以修饰SCP蛋白的关键抗原表位区域,提示这两种加工方法可以改变过敏原结构与抗原表位,从而降低SCP的致敏性。
摘要:目的:本研究以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为原料,探究酪氨酸酶处理拟穴青蟹原肌球蛋白对小鼠口服耐受的影响.方法:以纯化的原肌球蛋白(TM)为研究对象,采用酪氨酸酶(tyrosinase)对TM进行交联反应处理,并分析交联产物的交联程度、免疫结合活性,建立BALB/c小鼠模型检测交联产物对小鼠口服耐受的影响.结果:从SDS-PAGE结果和扫描电镜结果分析发现,酪氨酸酶可以催化TM发生交联(交联产物命名为CTC),产生大分子物质,其交联产物的结构更加紧密;用ELISA检测发现CTC的IgE结合活性降低34.5%;经小鼠口服耐受实验,发现交联组小鼠血清IgE和IgG1的水平明显下降,脾脏中Th2型细胞因子IL-4、IL-13的水平明显降低,使小鼠在一定程度上出现了口服耐受性.结论:TM作为拟穴青蟹的主要过敏原,采用酶法交联反应处理降低其免疫原性,可使小鼠产生口服耐受.今后将继续探索其口服耐受的免疫分子机制,为以后的临床治疗提供技术依据.
摘要:本研究以南白对虾(Penaeus vannamei)为研究对象,通过对虾肌肉中的多种过敏原进行纯化,建立酶法交联反应降低过敏原致敏性反应条件,为低致敏性食品开发提供依据。采用柱层析和SDS-PAGE等方法对目标蛋白纯化鉴定;应用多酚氧化酶建立酶法交联反应最优条件;利用虾过敏患者血清和兔抗多克隆抗体,采用Western-blot和Dot-blot对过敏原及加工产物的IgE和IgG结合能力进行分析;通过模拟胃肠液消化,探究蛋白的消化稳定性及消化产物免疫结合能力的变化。成功分离出对虾中的3种主要过敏原,原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)、精氨酸激酶(Arginine ki-nase,AK)和肌质钙结合蛋白(Sarcoplasmic calcium binding protein,SCP);建立了酶法交联反应体系,在800 U/mL酶活条件下,TM、AK和SCP(最佳反应时间分别为4h,48h,4h)均能发生交联反应且有聚合体产生;3种过敏原与IgG和IgE能够有效识别,交联产物的免疫结合能力均显著下降;AK交联产物在经胃蛋白酶消化后其IgG结合能力略有增强,可能是交联修饰掩盖到的抗原表位在消化过程中被破坏或暴露导致,但是3种交联产物在经过胃肠液消化后的IgG结合能力仍然比天然蛋白低。本研究通过酶法交联反应削减了南白对虾中的主要过敏原的致敏性,希望为低致敏性食品开发提供依据。
[专利] 发明专利 CN201610455643.4
集美大学 2016-11-09
摘要:一种鱼肉粽的加工方法,涉及食品粽子的加工。包括以下步骤:1)原料前处理:消减鱼肉的致敏性,将稻米和辅料浸泡;2)配料与煮制:将步骤1)中前处理后的物料和辅料混匀,调味并用粽叶包裹后上锅煮制;3)冷却:煮制后的产品密封,冷却,即得鱼肉粽成品,速冻后保存。通过酶法交联反应处理,降低鱼类中过敏原的致敏性,添加具有抗过敏作用的紫菜等辅料,于新鲜粽叶中煮制获得低致敏性的鱼肉粽。简单合理、可操作性强,制备的鱼肉粽致敏性低,营养丰富,味道鲜,食用方便。
摘要:目的:本研究以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为原料,探究酶法交联对其原肌球蛋白(tropomyosin,TM)变应原性和致敏性的影响。方法:以纯化的TM为研究对象,采用酪氨酸酶(tyrosinase)对TM进行酶法交联,并采用聚丙烯酰胺凝肢电泳(SDS-PAGE)分析交联程度;模拟胃肠液消化分析交联产物消化稳定性;用免疫印迹(Western blot)和点杂交(Dot blot)分析交联产物致敏性,进一步利用小鼠食物过敏模型评价交联产物致敏性。结果:SDS-PAGE显示,酪氨酸酶可使TM产生高分子交联聚合物;TM在模拟胃液消化15 min主条带部分降解而交联产物消化60min后高分子奈带仍存在;采用过敏患者血清对交联产物进行Western blot和Dot blot分析,结果表明交联产物的lgE结合活性降低;动物实验结果显示,TM交联产物组比TM组小鼠血清IgE/IgG1含量降低3-8倍。结论:本实验建立了TM与酪氨酸酶的交联方法,发现交联产物消化稳定性升高,致敏性降低,为低致敏性水产品的开发研制提供了理论依据。
摘要:目的:本文以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象,对其肌肉过敏原-肌质钙结合蛋白(Sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)进行重组表达,探究重组SCP的免疫结合活性.方法:参考NCBI数据库中SCP相关序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因,将目的基因与表达栽体pET-22b连接后转化至大肠杆菌中进行表达,重组蛋白经Sephacryls-200凝胶过滤柱层析纯化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测和免疫印速(Western blot)分析重组SCP的免疫结合活性.结果:对拟穴青蟹的肌肉组织RNA进行反转录,通过PCR扩增出579bp目的基因产物;将该基因与表达栽体连接后转化至大肠杆菌中,在30℃条件下经0.5mmol/L IPTG诱导8h,重组蛋白经柱层析纯化后的SDS-PAGE显示其分子量约为21 kDa;通过与兔抗青蟹SCP多克隆抗体、蟹类过敏患者血清的免疫印迹反应分析,证实重组表达SCP具有IG/IgE免疫结合活性.结论:本研究成功表达了拟穴青蟹SCP,重组SCP具有良好的IgG/IgE结合活性,可望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发.
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