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摘要:目的 寻求一种简单高效的分离培养小鼠被毛毛乳头细胞的方法.方法 取5周龄C57小鼠背部皮肤,刮去毛发后予0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化2h,刮下毛球部,经过2次Ficoll密度梯度离心后,得到纯净的毛乳头进行培养.检测毛乳头贴壁率、毛乳头细胞特异性标记表达及其体内毛囊重建能力.结果 该分离方法能显著降低工作强度,减少污染机会,获得的毛乳头贴壁快、细胞迁出快.qRT-PCR、细胞免疫荧光实验结果均证实体外培养的小鼠被毛毛乳头细胞可表达与毛囊诱导能力相关的特异性标记物ALP、β-catenin及Versican,且与触须毛乳头细胞相比差异无统计学意义(P>0.05).体外培养的小鼠被毛毛乳头细胞具有诱导毛囊再生的能力.结论 胶原酶消化结合Ficoll梯度离心是一种简单、有效地分离获取小鼠背部毛乳头的方法....
摘要:目的 研究Notch信号通路阻滞对人毛囊干细胞增殖分化的调节作用. 方法 收集2012年1月-2013年12月整形外科手术残留的头部皮肤组织,通过显微分离结合酶消化法分离人毛囊隆突区细胞,应用不同浓度的Notch信号通路阻滞剂DAPT处理后,观察对细胞的克隆形成能力、细胞周期及细胞凋亡,并进行分析. 结果 Notch信号阻断后,对人毛囊干细胞的增殖、分化及凋亡具有一定的调节作用,其中20 μmol/L药物处理组克隆形成率提高到(84±12)%,细胞总凋亡比例下降为3.81%.Western blot结果示N1ICD、Hes1及p21表达均有降低,Wnt-10b的表达上调. 结论 Notch信号通路阻滞剂DAPT能有效提高人毛囊干细胞比例,减少细胞凋亡,其调节机制可能与其对p21表达的调控以及与Wnt通路的交互作用有关....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:眉毛不但是面部轮廓的重要组成部分,同时也具有保护眼睛和传递感情的作用,因此,外伤后引起的瘢痕性眉缺损,严重影响患者的外表形象和自信¨].以往所采用的岛状头皮瓣和头皮游离移植,已不能满足现代人对美的追求[2],目前,采用单株毛囊移植法进行眉毛和睫毛移植的技术取得了较快发展[3-8].2010年8月至2011年12月,我们采用含有单根毛发的毛囊单位移植治疗瘢痕性眉缺损52例,取得较好的美容效果....
摘要:目的 探讨富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对小鼠触须毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)活性和毛囊重建的影响.方法 将采用2步离心法制备的PRP与采用显微解剖法获得的DPCs共培养,显微镜下观察细胞的形态变化,通过MTT法检测第4和第8代DPCs细胞活性.将新鲜分离的C57BL/6J小鼠背部表皮细胞与第4代的DPCs混合制成含有不同终浓度PRP的细胞悬液并移植至裸鼠体内,观察移植区域毛发形成的时间,4周后处死裸鼠,HE染色计算各组毛囊数量.结果 通过2步离心法获得的PRP中含有的血小板数量约为全血的8.3倍,与未加PRP的对照组比较,终浓度为5%和10% PRP组不但可促进前6代DPCs的聚集性生长,还可促进前8代DPCs的增殖.在裸鼠体内实验中,10% PRP组长出毛发的最早时间和形成毛囊的数量分别为(18±1)d和(344±27)根,对照组为(20±1)d和(288±35)根,差异有统计学意义(P<0.05).结论 PRP既能够增强DPCs的活性,也有助于毛囊的重建....
摘要:目的:探讨Wnt10b对体外长期培养的人毛乳头细胞诱导毛囊生成能力的影响作用.方法:将人毛乳头细胞在体外传代培养到第8代后,加入人重组蛋白Wnt10b共培养,通过免疫荧光染色检测人毛乳头细胞的β-catenin表达,Real-time QPCR检测与毛乳头细胞诱导能力相关的特异性标记物碱性磷酸酶(ALP)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达,以及ALP染色检测Wnt10b对人毛乳头细胞的作用.结果:Wnt10b能够通过经典的Wnt/β-catenin信号通路作用于体外长期培养的人毛乳头细胞,上调人毛乳头细胞特异性标记物ALP和IGF-1的表达,从而维持人毛乳头细胞的诱导能力.结论:Wnt10b能够通过上调特异性标记物ALP和IGF-1的表达来维持体外长期培养的人毛乳头细胞的毛囊诱导能力....
摘要:目前治疗瘢痕性秃发主要依赖于自体毛发移植.该法不适用于供区不足的患者.高效率的毛囊重建是研究热点.体外重建技术尚未成熟,但已有小室法、注射法等动物模型.小室法是将细胞注入裸鼠背部创面上的小室[1].注射法是将细胞注入裸鼠皮下[2].小室法毛发能长出体表但较费时.注射法较快捷但毛发不能长出体表[3].只有小室法需形成覆盖创面的上皮.上皮化过程可能是影响小室法毛囊重建效率的原因之一.高压氧能促进创面上皮化及皮片成活[4].但小室中的细胞为外源性且排列无序,其成活方式不明.本研究旨在观察就高压氧对小室模型的作用....
摘要:自2011年5月至 2012年5月,我们对23例患者采用台式放大镜辅助毛发移植进行眉毛移植术,获得了较好的效果.现报道如下. 1 临床资料 本组患者共23例.男性8例,女性15例;年龄16~40岁.双侧眉毛稀疏者3例;烧伤或外伤患者20例,其中双侧瘢痕性眉毛缺失16例,单侧4例....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:目的 构建一种可靠、有效、实用的毛囊重建模型.方法 于6只裸鼠背部分别植入4个直径为2.5mm的微型小室,分离新生C57BL/6小鼠皮肤中表皮和真皮细胞,真皮细胞标记后以1∶1比例移植至微型小室内,1周后拆除小室,通过宏观、扫描电镜及组织学观察毛发再生.结果 移植后4周,6只裸鼠,24个移植部位均有黑色毛发生长,毛囊重建成功率为100%.冷冻切片荧光检测见毛乳头为红色荧光,石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色见毛囊结构发育完整,电镜扫描见毛发生长方向规整,毛发质量优异.结论 新生鼠皮肤细胞微型小室法移植后能成功构建毛囊发育模型,此模型具有创伤小、操作简便、所需细胞量少、可做多个部位移植的优点,是一种可靠、有效、实用的毛囊重建模型....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:目的 构建一种简便、可靠、直观的毛囊发育模型以检测毛囊细胞的毛发诱导能力,探讨毛囊形态发生和周期循环的分子机制.方法 于裸鼠背部植入一开放小室,将新生C57BL/6鼠皮肤中的真皮和表皮细胞分离,并按一定的比例混合移植至小室内,1周后拆除小室,观察毛发形成及毛发拔除后的再生情况.结果 细胞移植后1周,创面湿润无明显收缩,中间有淡红色半透明组织形成.移植后2周,创面完全愈合.移植后3周有黑色毛发长出皮肤.移植后4周,浓密黑色毛发垂直于皮肤表面生长,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整.毛发拔除后1周能够再生出新的毛发.细胞以不同的比例移植,真皮细胞数量为1 × 107、表皮细胞数量降至1 ×106时,毛囊重构的效率并无明显改变.表皮细胞数量为1×107、真皮细胞数量降至5×106或者更少时,再生毛发的数量明显减少,两者单独移植均无毛发生长.结论 新生鼠皮肤细胞以小室法移植后可以构建毛囊发育的完整模型,并可用于检测毛囊细胞的诱导能力,以研究毛囊形态的发生和周期循环的分子机制....
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北大核心 CSTPCD CA
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摘要:目的:对聚酰胺人工毛发纤维改良后进行毛发移植,研究其与常规移植方法的组织相容性及远期脱落率差异,以促进聚酰胺人工毛发纤维的临床应用.方法:对聚酰胺人工毛发纤维的固定结部分进行改良,由传统的单结改为双结.选取新西兰大白兔作为实验动物分别行常规和改良后的聚酰胺人工毛发纤维移植手术,定期取材行HE染色观察其组织相容性,分别于移植术后1周、1个月、3个月、9个月、12个月进行脱发计数以计算远期脱落率.结果:与对照组相比,经过改良后的聚酰胺人工毛发纤维在组织相容性方面差异无显著性,在远期脱落率方面显著降低.结论:改良后的聚酰胺人工毛发纤维并不引起更强烈的组织排斥,且能够更好地与头皮锚定在一起,大大改善了人工毛发移植术后的远期效果....
[博士论文] 肖顺娥
外科学(整形) 南方医科大学 2018(学位年度)
摘要:目的:
  构建组织工程毛囊实现毛囊再生是治疗秃发较有前景的方案。构建组织工程毛囊三大经典要素分别为:种子细胞、细胞支架和信号分子。
  毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)是毛囊重建重要的种子细胞。但是,在常规二维培养过程中,DPCs随着传代次数的增加而逐渐丧失其毛发诱导能力。短时间内大量获取具有诱导能力的DPCs仍比较困难。因此,改善DPCs体外培养条件,扩增细胞数量的同时维持甚至增强其诱导能力至关重要。此外,寻找一种合适的毛囊组织工程支架材料也很有必要。
  富含血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)经激活后可释放出大量的生长因子,可促进细胞增殖、分化,临床研究表明PRP可用于秃发的治疗,促进毛发生长。PRP凝胶结构呈渔网状,细胞在胶内可存活并增殖,是一种合适的组织工程支架材料。因此,在本实验中通过在培养基中添加激活的PRP改善DPCs体外培养条件,并对PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建及用于DPCs三维培养的可行性进行了探讨。该研究结果,不仅为快速获取大量的具有诱导能力的DPCs提供新的方法,也为秃发的治疗提供新策略。
  方法:
  1.PRP对小鼠及人来源DPCs生物学影响的研究
  两步离心法提取PRP,经激活后将不同浓度的激活的PRP上清液添加至培养基中培养小鼠及人DPCs,通过CCK8增殖试验筛选出最佳促DPCs增殖的PRP上清液浓度,并对最佳浓度培养条件下的DPCs进行免疫荧光、Western-blot、PCR检测PRP对DPCs生物学活性和特性的影响。通过动物体内毛囊重建模型检测DPCs诱导能力。
  2.PRP对人DPCs生物学影响的机制研究
  通过免疫荧光及Western-blot对人DPCs细胞表面磷酸化受体表达情况进行了检测,并通过人磷酸化蛋白芯片对受体所介导的信号通路进行了检测。
  3.PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建的研究
  将DPCs、上皮细胞与适量的PRP混合后经凝血酶激活形成包含生发细胞的PRP凝胶,将此凝胶移植至裸鼠背部创面,观察毛囊重建的情况。
  4.PRP凝胶作为人DPCs三维培养支架的可行性研究
  将不同数量级及不同代数的人DPCs接种至PRP凝胶上进行培养,观察细胞生长状况及聚集成球情况。
  结果:
  1.PRP对小鼠及人来源DPCs生物学的影响
  低浓度激活的PRP可促进人和鼠DPCs增殖,其中5%浓度具有最强的促DPCs增殖作用。对添加5%激活的PRP培养条件下的DPCs的生物学功能指标进行了蛋白水平及基因水平检测,发现与其诱导能力相关的标记物ALP、β-catenin及Versican较对照组均表达上调。动物实验证实添加5%激活的PRP培养的小鼠DPCs较普通培养基培养的DPCs具有更强的毛囊诱导能力。而人DPCs与新生鼠上皮细胞通过微型小室法移植并不能重建出毛囊。
  2.PRP对人DPCs生物学影响的机制研究
  添加5%激活的PRP培养条件下的DPCs细胞表面磷酸化受体FGFR1,
  PDGFRα及PDGFRβ蛋白表达水平明显上调。蛋白芯片结果显示人DPCs磷酸化ERK,JUK,p38及Akt信号蛋白表达水平均出现明显上调,GSK-3信号蛋白表达水平下调。
  3.PRP凝胶作为细胞支架用于毛囊重建的研究
  包含小鼠DPCs及新生鼠上皮细胞的PRP凝胶移植到裸鼠背部创面后可重建出新的毛囊,且毛发拔除后能够再生新的毛发。而包含人DPCs及人包皮上皮细胞的PRP凝胶移植到裸鼠背部创面后不能重建出新的毛囊。
  4.PRP凝胶作为人DPCs三维培养支架的研究
  人DPCs以0.5×104、1×104、2×104每孔的数量级接种至96孔板PRP凝胶上培养,细胞既不贴壁生长也不聚集成球;增大密度至5×104时,每孔仅可见数个细胞聚集体形成,且形状不规则,细胞间连接不紧密,其他绝大部分细胞均呈接种时的圆形状态;低代与高代DPCs生长方式相似。
  结论:
  1.培养基中添加5%激活的PRP上清液可明显促进小鼠及人DPCs的增殖,并增强其毛囊诱导能力。
  2.PRP促进人DPCs增殖并增强其诱导能力是通过上调磷酸化受体FGFR1,PDGFRα及PDGFRβ的表达,从而激活MAPK、Akt及Wnt信号通路。
  3.PRP凝胶可作为细胞支架用于组织工程毛囊再生。
  4.PRP凝胶不适用于人DPCs的三维培养。
[硕士论文] 肖顺娥
整形外科 南方医科大学 2013(学位年度)
摘要:背景:毛囊的形态发生是上皮与真皮细胞间相互作用的结果。上皮中的多能干细胞和真皮中的毛乳头细胞是毛囊形态发生中不可或缺的成分,但这两者间通过何种机制发生作用,有哪些信号、因子参与目前尚不完全清楚。体外构建功能完整的毛囊比较困难,因为它需要比较复杂的三维空间结构。毛囊重建的体外模型已从单层毛囊细胞的培养演变到用毛囊细胞三维构建含有毛囊的人造皮肤。虽然,这对毛囊组织工程研究具有一定价值,但是,体外毛囊模型的构建在回答一些有关毛囊发育信号通道和毛发周期调控复杂的问题上存在一定的缺陷。在体内,毛囊除通过血管供应营养物质和氧气外,也通过旁分泌机制接受来自邻近细胞的信号分子,如生长因子、细胞因子的调节[3-4]。而体外毛囊的重建由于营养物质、氧气、信号分子的缺失或者减少并不能完全模型体内毛囊发育过程。因此,建立适宜的体内毛囊发育模型用以研究毛囊形态发生及周期循环分子机制非常重要。毛囊细胞移植是治疗秃发的一种实验性细胞疗法,以获取增殖能力强并且具有毛囊诱导能力的毛乳头细胞为前提。但是,毛乳头细胞经体外培养扩增后其诱导能力会逐渐丧失。目前,与毛乳头细胞诱导能力相关的明确的细胞表面标志尚未得到识别,也没有简便的体外实验用以检测毛乳头细胞的毛发诱导能力。因此,建立一个简便、可靠,并能够直接检测毛乳头细胞诱导能力的动物模型也很有必要。目前,有多种毛囊重建体内模型。小室法,最早由Lichti和Weinberg介绍使用,Lichiti在2008年又对此模型进行了改进,是已确定的可用于毛囊重建研究的模型之一。另外一种模型是注射法,最先由Morris介绍使用,后来Zheng对此模型进行了改善。注射法是将上皮和真皮细胞的混合物注射至真皮内重建毛囊。三明治法最先由Reynolds和Jahoda介绍使用,是将毛乳头细胞插在供体大鼠足垫皮肤的上皮与真皮之间,然后将复合物移植至受体鼠皮肤创区。皮瓣法是近来发展的,是在裸鼠背部置于一块硅胶板,将上皮薄片平铺在硅胶板上,然后将真皮细胞移植至上皮薄片上,最后将裸鼠背部皮瓣覆盖缝合。每种毛囊重建体内模型均有其适用情况,小室法具有较好的重复性,被广泛应用。上皮与真皮细胞被移植到小室后两者能够密切接触,为毛囊的重建提供了适宜的空间和环境,并排除了受体自身细胞的干预。移植后3周移植部位有新的毛发长出,毛发质量、密度与正常毛发相似,这为毛囊重建的评估提供了最直接的证据。实验中,我们构建了小室法毛囊发育模型,并探讨了上皮与真皮细胞何者在毛囊重建中起主导作用。但是,小室法仍存在一些缺陷,如对动物创伤太大;皮肤创面容易感染随后动物死亡;需要大量的细胞(大约需1×107上皮细胞+1×107真皮细胞);一只动物只能做一个小室移植。这将一定程度上影响毛囊重建的成功率。另外,一些很难获取的或者经过特殊处理的细胞用小室法移植,实验难度与实验耗费会明显增加。因此,我们尝试使用微型小室进行细胞移植,以期改善上述不足。毛乳头细胞是毛囊重建中不可或缺的真皮成分。目前,国内外学者主要通过显微解剖法和酶消化法分离获取鼠触须毛囊和人头皮毛囊中的毛乳头细胞,其工作难度大,获取率低。在毛囊重建的研究中,迫切需要一种简便的方法来获取大量的具有诱导能力的毛乳头细胞。出生后1d内的C57小鼠背部皮肤中毛囊大部分处于形态发生第4阶段之前,真皮中含有的大量的具有诱导能力的毛乳头细胞。将新生鼠真皮细胞经体外培养扩增这为毛乳头细胞的来源提供了一种理论可行的途径。我们用培养的真皮细胞与新鲜的上皮细胞一起移植,以探讨培养的真皮细胞用于毛囊重建的可行性。
   目的:①构建小室法毛囊重建模型;②构建微型小室法毛囊重建模型;③探讨培养的新生鼠真皮细胞用于毛囊重建的可行性。
   方法:⑴取新出生1d内的C57BL/6近交系小鼠背部皮肤,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗后,用显微镊将表皮和真皮分离并分别剪碎,分别用0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基,分别调整细胞浓度为1×107个/ml。取真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(1×107个)用200μl高糖培养基(不含FBS)重悬后备用。同时,调整真皮细胞与表皮细胞不同的比例,分别为真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(5×106个)、真皮细胞(1×107个)+表皮细胞(1×106个)、真皮细胞(1×107个)、真皮细胞(5×106个)+表皮细胞(1×107个)、真皮细胞(1×106个)+表皮细胞(1×107个)、表皮细胞(1×107个),分别用200μl高糖培养基重悬后备用。用5ml离心管的盖子制备成小室。取5ml离心管,将盖子剪下并将其中央部分去掉,在盖子下端贴一层扎有多个小孔的纸胶布,高压消毒后备用。受体裸鼠予腹腔注射戊巴比妥钠0.4 ml/100g(10 mg/ml)麻醉后,以安尔碘消毒背部皮肤3遍,剪刀剪下1块圆形皮肤,深达肉膜,直径为小室直径的一半。把制备好的小室插入到皮肤与肉膜之间,上端暴露于空气中,将盖子周边松弛皮肤缝合固定,形成一个可以容纳细胞悬液的开放小室。将细胞混悬液注射至小室内,3d后在小室顶部中央剪孔以促使创面干燥,1周后拆去小室。分别于细胞移植后1、2、3、4周大体观察移植部位毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后移植部位取材,10%甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,镜下观察。细胞移植4周后将移植部位的毛发全部拔除,观察毛发再生情况。⑵取出生后1d内C57BL/6J小鼠背部皮肤,并剪成0.5 cm×0.5 cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗3次后,将其表皮和真皮分离,真皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000 r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬。将新出生1d内的绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠背部皮肤剪成0.5 cm×0.5cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜后将其表皮和真皮分离,表皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶消化37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。细胞加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000 r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬。配制DiI储存液:取5mg DiI避光、37℃溶于20μl DMSO,-20℃冻存。取1μl DiI储存液加入300μl PBS稀释后以3000 r/min离心5min,真皮细胞悬液以1000 r/min离心5 min后弃掉上清液加入200μl DiI染液,混匀,染色5-7min后加入PBS清洗并低速离心,细胞沉淀加入DMEM重悬并调制细胞浓度为1x106个/ml备用。将直径为2.5mm的硅胶管制备成微型小室,高压消毒后备用。裸鼠腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml)麻醉成功后,安尔碘消毒背部皮肤3次,在背部剪下直径为2mm的圆形皮肤,深达肉膜。把制备好的微型小室插入皮下与肉膜间,上端暴露于空气中,将小室周边荷包缝合一圈,防止小室脱落,每只裸鼠移植4个微型小室。细胞以以下组合用20μl高糖培养基重悬后分别注射至微型小室内,1周后拆去小室。(i)真皮细胞(5x106个)+表皮细胞(5x106个);(ii)真皮细胞(2x106个)+表皮细胞(2x106个);(iii)真皮细胞(1x106个)+表皮细胞(1x106个);(iv)真皮细胞(5x105个)+表皮细胞(5x105个);(v)真皮细胞(1x105个)+表皮细胞(1x105个);(vi)真皮细胞(5x104个)+表皮细胞(5X104个)。另外,分别用DiI标记的真皮细胞(5x105个)+未标记的表皮细胞(5x105个);GFP转基因小鼠的表皮细胞(5x105个)+未标记的真皮细胞(5x105个)用微型小室移植。细胞移植后1、2、3、4周,大体观察移植部位毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后,移植部位取材,石蜡切片HE染色、冷冻切片荧光检测和扫描电镜观察。将移植部位的毛发用镊子直接全部拔除,观察毛发再生情况。⑶取出生后1d内C57BL/6J小鼠背部皮肤,并剪成0.5 cm×0.5 cm大小,用0.1%中性蛋白酶4℃消化过夜。PBS(含1%青、链霉素)漂洗3次后,显微镊将其真皮和表皮分离,真皮剪碎,0.2%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h左右,间断吹打,直到所有组织被消化。加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)终止消化。用200目筛网过滤,以去除组织碎块和细胞团块,将收集的单细胞混悬液于离心管中以1000 r/min离心5min,重复离心2次,吸去上清液,加入DMEM高糖培养基重悬,台盼蓝染色法检测细胞存活率。调整细胞浓度为1x106个/ml,取1ml细胞悬液接种至10cm培养皿中并加入6ml培养基,置于孵箱中培养,24h换液。细胞长至80%融合时传代培养。表皮用0.25%胰蛋白酶于37℃消化10 min,表皮细胞的制备过程与真皮细胞相似。将27只受体裸鼠随机分为4组,每只裸鼠背部移植4个微型小室。细胞以以下组合重悬于20μl高糖培养基后移植至微型小室内(表皮细胞5x106个;真皮细胞5x106个)。新鲜上皮细胞+新鲜真皮细胞(组1);新鲜上皮细胞+P0真皮细胞(培养3d,组2);新鲜上皮细胞+P1真皮细胞(组3);新鲜上皮细胞+P0真皮细胞(培养过夜,组4)。1周后拆去微型小室。移植后(1、2、3、4周)大体观察毛囊形成、发育及毛干生长情况。4周后移植部位取材,10%甲醛固定,常规石蜡切片,HE染色,显微镜下观察。
   结果:①细胞移植后1周,创面湿润无明显收缩,中央形成淡红色半透明组织。细胞移植后2周,创面完全愈合。细胞移植后3周,移植部位有黑色毛发长出皮肤。细胞移植后4周,浓密黑色毛发垂直于皮肤表面生长,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整。将移植部位毛发拔除后1周能够再生出新的毛发。将细胞以不同的比例移植,真皮细胞数量为1×107而表皮细胞数量降至1×106时,毛囊重构的效率并无明显改变。表皮细胞数量为1×107而真皮细胞数量降至5×106或者更少时,再生毛发的数量明显减少,两者单独移植均无毛发生长。移植部位的毛发拔除后,毛囊能再生出毛发并在3w内达到原来的长度。②细胞移植4周后可见移植部位有大量黑色毛发垂直皮肤表面生长。移植的细胞数量改变时,毛囊重建的效果也随之改变。当移植的上皮与真皮细胞数量分别由5x106降低至2x106时,毛囊重建的效果并无明显改变。但当上皮与真皮分别降低至5x104时,移植部位无毛发生长,仅有黑色色素沉着。毛发生长部位取材,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整,电镜扫描见毛发生长方向规整,毛发质量优异与正常毛发无明显差异。冷冻切片荧光检测见毛囊毛乳头部位为红色荧光,毛囊上皮成分为绿色荧光。重建的毛囊能维持至少6个月,毛发被拔除后毛囊能够再生出新的毛发。③新鲜上皮细胞与培养的真皮细胞移植后,组2(新鲜上皮细胞+P0真皮细胞,培养3d);组3(新鲜上皮细胞+P1真皮细胞)移植部位均未见毛发生长,仅有黑色色素沉着。移植部位组织学观察未见毛囊形成。组4(新鲜上皮细胞+培养过夜的真皮细胞)移植部位可见浓密黑色毛发长出,与组1(新鲜上皮细胞+新鲜真皮细胞)长出的浓密黑色毛发外观无明显差异。移植部位组织学观察见毛囊结构发育完整。
   结论:⑴新生鼠皮肤细胞以小室法移植后可以构建毛囊发育的完整模型,此模型可用于检测毛囊细胞的毛发诱导能力,以及研究毛囊形态发生和周期循环的分子机制。⑵微型小室法毛囊重建模型具有所需细胞量少、创伤小、并发症少、毛囊重建成功率高的优点,是一种可靠、实用的毛囊重建模型。尤其是所需细胞量少,一只动物可以做多个部位移植,可以明显降低实验难度和实验耗费。⑶新生鼠真皮细胞经培养过夜后,既排除了上皮角质细胞的污染,同时又保留了真皮中具有诱导能力的毛乳头细胞,可用于毛囊重建实验研究。
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