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华中农业大学
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[期刊论文] 徐引弟 陈焕春 肖少波
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北大核心 CSTPCD CA
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摘要:以伪狂犬病毒Ea株Bam H I 5'片段为模板,PCR扩增出约0.9 kb gK基因完整编码区片段,将该基因克隆到pBluescriptIISK+中,构建重组载体pSKgK.进一步将该片段插入真核表达载体pEGFP-C1的增强绿荧光蛋白EGFP下游,构建真核表达载体pEGFPgK,脂质体法转染BHK-21细胞,G418筛选至正常细胞完全死亡,在倒置荧光显微镜下观察,pEGFPgK转染的细胞在细胞膜和细胞浆中发出很强的荧光,而正常细胞不发荧光.证明gK基因在BHK-21细胞上获得了表达,表达在细胞膜和细胞浆中....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:对高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(HP_PRRsV)人工感染的成年猪脏器进行透射电子显微镜观察,结果发现,肺部组织细胞病变最严重.部分毛细血管破裂.毛细血管内皮细胞裂解.肺泡巨噬细胞线粒体嵴肿胀严重;脑部组织神经元细胞凋亡和胶质细胞坏死;肾脏和淋巴结组织中均出现病毒的复制和线粒体嵴的肿胀.该结果为阐明HP-PRRSV的致病机理提供了实验依据....
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CSTPCD 北大核心
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摘要:δ冠状病毒(Deltacoronavirus)是冠状病毒科冠状病毒亚科的新成员,可感染鸟类和哺乳动物.δ冠状病毒最早于2007年从亚洲豹猫和中国白鼬獾群中检测到.2014年,猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)在美国流行并成功分离到病毒,人工感染实验证实PDCoV可导致仔猪腹泻,具有较强的致病性,成为研究δ冠状病毒的良好模型.本文对PDCoV的发现、病原学、流行病学、致病性、培养与检测等方面进行综述....
摘要:对克隆有伪狂犬病病毒Ea 株基因组DNA SphI 15 kb片段的质粒pBSA用SphI和 KpnI消化 ,将含gG全基因及其上游PK基因、下游gD基因部分编码区约2.6 kb的片段亚克隆到消除了Eco RI位点的载体pUC19中,获得重组质粒pUSK(E).以pEGFP?N1为模板,通过PCR扩增约0. 3 kb的 SV40 Poly(A)片段,并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI 位点,利用p FastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40 Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点,在插入的同时导致gG 基因5'端编码区约400 bp的缺失,构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni.序列分析进一步证实:有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入.上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础....
[期刊论文] 徐引弟 陈焕春 肖少波
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北大核心 CSTPCD
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摘要:以伪狂犬病毒Ea株BamHⅠ5′片段为模板,PCR扩增出约0.6kb ORF-1基因完整编码区序列,将该基因克隆到pBluescriptⅡSK+中,构建重组载体pSKORF1.进一步将该片段插入真核表达载体pEGFP-C1的增强型绿荧光蛋白EGFP下游,构建真核表达载体pEGFPORF1,脂质体法转染BHK-21细胞,G418加压筛选至正常细胞完全死亡.在倒置荧光显微镜下观察,可见pEGFPORF1转染的细胞在细胞膜和细胞浆中发出较强的荧光,证明ORF-1基因在BHK-21细胞中获得了表达....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA SCIE CBST
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摘要:由于伪狂犬病病毒(PRV)中G+C含量高达74%,至今尚没有一个毒株完成全基因组测序.对已知的68个PRV基因编码区序列碱基组成及密码子使用现象进行了统计分析,结果发现PRV基因中存在非常强的密码子使用偏差.所有68个PRV基因编码区密码子第三位总的G+C含量为96.24%,其中UL48基因高达99.52%.PRV基因偏向于使用富含GC的密码子,特别是以C或G结尾的密码子.此外,还发现PRV中G+C含量变化较大的UL48、UL40、UL14和IE180等基因附近正好与已知的PRV基因组复制起始区相对应.根据基因功能将PRV基因分为6类进行分析发现,基因功能相同或相近的基因其密码子使用模式相似,其中调节基因的同义密码子相对使用度(RSCU)与其他基因有显著差异,在调节基因中以C结尾的密码子的RSCU值远大于其他同义密码子.最后,对PRV基因氨基酸组成差异进行多元分析,发现不同功能的PRV基因在对应分析图上分布不同,表明PRV基因密码子使用模式可能与基因功能相关....
[博士论文] 肖少波
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2004(学位年度)
摘要:该研究探讨了伪狂犬病毒最主要的保护性抗原基因gC基因"自杀性"DNA疫苗的免疫原性和保护效力;研究了伪狂犬病毒VP22的蛋白转导特性;比较了4种VP22的蛋白转导特性及其增强DNA疫苗免疫反应的差异并筛选了增强效果最好的VP22;评价了所筛选的VP22增强不同分子量大小的模式抗原以及PrV gC基因"自杀性"DNA疫苗免疫反应的能力.主要研究内容如下:1.PrV Ea株gC基因的克隆与序列分析.从PrV Ea株基因组DNA中通过酶切和Southern杂交克隆了完整的gC基因进行了序列测定、糖基化位点和抗原表位预测、进化系统分析与序列比较.2.gC基因在大肠杆菌中的高效表达与gC-ELISA方法的建立.以pET-28a为载体,构建了gC基因的原核表达pETC1.5,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,表达蛋白的分子量约为62kDa,主要以包涵体形式存在,Western blot检测证实具有良好的反应原性.3.伪狂犬病毒gC基因"自杀性"DNA疫苗的免疫保护.分别以pcDNA3.1+和pSFV-DNA为载体,构建了gC基因的常规DNA疫苗表达质粒pcDC和"自杀性"DNA疫苗表达质粒pSFVC1.5,转染BHK-21细胞,Western blot检测证实两种表达质粒均能正确表达gC,而且pSFVC1.5还能诱导转染细胞发生细胞凋亡.4.伪狂犬病毒VP22蛋白转导特性.构建了PrV VP22(PVP22)与绿荧光蛋白突变体mut4EGFP融合的真核表达质粒pcPM4,转染Hela细胞并与mut4EGFP非融合表达质粒(pcM4)进行比较,发现PVP22-mut4EGFP融合蛋白的荧光呈多种分布,但主要以颗粒的形式分布在核或核外周,也有部分细胞的荧光呈胞浆分布,而pcM4转染细胞的荧光全部呈弥漫型,分布于整个细胞.5.与PVP2融合增强mut4EGFP DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫.以pTWIN1为载体,在大肠杆菌中高效表达了mut4EGFP.采用几丁质亲和层析,获得了高纯度的重组mut4EGFP蛋白,可作为ELISA检测抗原.将表达PVP22-mut4EGFP融合蛋白的质粒pcPM4免疫小鼠,并与mut4EGFP非融合表达质粒pcM4进行比较,发现与PVP22融合表达能显著增强mut4EGFP特异性ELISA抗体和CTL活性,而PVP22和mut4EGFP两种非融合表达质粒的联合免疫不能增强免疫反应,表明免疫反应的增强是PVP22蛋白转导作用的结果.6.比较4种VP22增强DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫.比较了PrV、BHV-1、HSV-1和MDV-14种VP22的氨基酸同源性,发现4种VP22近C末端长约80个氨基酸,即:PVP22的149-231AA、BVP22的146-228AA、HVP22的174-256AA、MVP22的92-174AA,呈现高度的同源性,推测是VP22潜在的蛋白转导结构域;预测了4种VP22的空间结构.7.BVP22增强模式抗原"自杀性"DNA疫苗的体液免疫和细胞免疫.构建了与BVP22融合的mut4EGFP自杀性"DNA疫苗pSCAM4,体外检测证实pSCAM4表达的融合蛋白BVP22-mut4EGFP也具有蛋白转导能力.8.与BVP22融合显著增强gC基因"自杀性"DNA疫苗的免疫反应和保护效力.构建了与BVP22融合的gC基因"自杀性"DNA疫苗pSFVBC1.5,将pSFVBC1.5与pSFVC1.5免疫BALB/c小鼠,结果pSFVBC1.5诱导的ELISA抗体、中和抗体和CTL活性均显著高于pSFVC1.5免疫组.
[期刊论文] 马相如 肖少波 陈焕春
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:单纯疱疹病毒UL41基因编码的病毒宿主关闭蛋白(VHS蛋白)是一种核酸酶,具有mRNA剪切活性,可引起宿主细胞蛋白质合成的快速关闭.通过干扰IFN-α/β介导的抗病毒免疫反应、降低宿主细胞MHC Ⅰ和MHCⅡ类分子的表达、减少免疫系统中病毒抗原的提呈以及抑制宿主先天免疫反应等,VHS蛋白在α疱疹病毒的发病机制和免疫逃避过程中发挥重要作用....
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北大核心 CSTPCD CSCD AJ CA CBST
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摘要:利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游,并在大肠杆菌中成功表达,获得了大小约为60kD的融合蛋白GST-GP5-M,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪繁殖与呼吸综合征P56-ELISA检测方法,与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为94.1%,表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性.进一步分析了P56-ELISA检测结果与血清中和试验的相关性,经回归函数分析,发现在临床送检猪血清中的抗融合蛋白GP5-M抗体水平(OD630nm)与中和抗体水平之间的相关性并不高....
摘要:以牛疱疹病毒I型 (BHV-I) 国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约0.77kb 的ul49基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体中,获得含ul49基因的重组质粒pMD-VP22.采用双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株ul49基因序列完全一致,说明ul49基因相当保守.进一步将BHV-I ul49完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C1中,获得分别与6xHis融合的原核表达质粒pET-28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22.将pET-28aVP22转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测发现在38kDa处有一条特异性的表达带.利用脂质体介导,将pEGFPVP22转染PK-15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆.在倒置荧光显微镜直接检测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP- C1转染细胞的荧光分布于胞浆....
摘要:兽医传染病学是研究家畜、家禽、宠物和野生动物传染性疾病及人兽共患传染病发生发展和流行规律以及预防控制和消灭这些传染病的方法的科学....
摘要:对含伪狂犬病病毒(PRV)鄂A株gG全基因,PK、gD基因部分编码序列的质粒pUSK进行改造,消除其中的EcoRⅠ位点,将通过PCR扩增的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)融合到gG启动子下游,构建了由gG启动子控制EGFP表达的PRV转移载体pgG-/EGFP+。该转移载体单独转染或同PRV基因组DNA共转染IBRS-2细胞,结果单独转染时EGFP不能表达;共转染时,6 h就可在荧光显微镜下观察到明显的荧光。...
摘要:对含伪狂犬病病毒Ea株gC全基因的质粒pUC1.75进行亚克隆,将其完整编码区置于真核表达载体pcDNA3.1+的HCMV启动子/增强子下游,构建了gC基因真核表达质粒pcDNAgC.脂质体转染IBRS-2细胞,在G418抗性选择下,获得多个阳性克隆细胞系.经ELISA筛选反应最强的阳性克隆细胞系,进一步用间接免疫荧光检测证实gC基因在IBRS-2细胞中得到了正确表达并分布在细胞膜.以100个蚀斑形成单位的伪狂犬病病毒分别接种表达gC的细胞系和空白载体转染细胞系.通过测定蚀斑数发现,表达gC的细胞系对病毒的感染具有抑制作用,平均抑制率达59.4%±1. 3%....
摘要:以伪狂犬病病毒Ea株(PRV-Ea)细胞感染物为模板,PCR 扩增出1.23?kb的EP0基因完整编码区片段,将该基因片段克隆到pBluescriptⅡsk+中并构建三个测序质粒,双脱氧末端终止法序列测定并同国外InFh株进行同源比较,发现PRV-Ea EP0基因存在多处点突变和一处缺失突变,但无插入突变和移码。进一步将该片段插入到原核表达载体pET-28a的His-Tag下游,构建的原核表达质粒pETEP0在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白分子量为62?kD,并形成包涵体。Western印迹分析表明,该蛋白带能与Ea株野毒高免血清发生特异性反应,证实PRV-Ea EP0基因在BL21(DE3)中获得了正确表达,并且具有免疫学活性。为今后深入研究该基因的功能奠定了基础。...
摘要:根据伪狂犬病病毒国外Ka株UL54基因核苷酸序列,设计一对包含UL54基因完整编码区的引物,以伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株细胞感染物为模板,PCR扩增出大小约1.1kb特异性带。将纯化的扩增产物克隆到pBluescriptⅡsk+中,酶切分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析结果表明Ea株UL54基因全长1 086 bp,可编码361个氨基酸。由二级结构预测数据推断C-末端具有典型的锌指结构域。运用Blast软件与Ka株UL54基因进行同源比较,发现Ea株UL54基因在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处点突变,但无插入或缺失突变;将Ea株UL54氨基酸序列同其它4种α-疱疹病毒(HSV-1、HSV-2、VZV、EHV-1)进行同源比较,同源性分别为47%、36%、36%和44%。...
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:依据伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus PRV)Rice株序列合成针对gG基因的特异性引物,从PRV鄂A株中扩增出gG基因,并将其克隆到pBluescriptⅡSK+质粒中并测序,用SacⅠ和HindⅢ酶切,将gG基因融合到pET-28a质粒中T7启动子下游,构建成原核表达质粒pET-28a-gG1,结果并未获得表达.再用NotⅠ切除gG基因后小半部分片段,构建成原核表达质粒pET-28a-gG2,使其在E.coli BL21(DE3)中以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达特异带为47KDa,斑点杂交证实表达产物具有抗原性.表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液的上清之中,上清经饱和硫酸铵溶液沉淀,透析,PEG20 000浓缩,ELISA分析表明,经初步纯化的表达产物可与抗PRV猪血清发生特异性免疫反应.用该产物致敏空白乳胶建立gG-乳胶凝集试验(gG-LAT),检测340份血清,结果表明gG-LAT能区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪,且特异性强、敏感性高....
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北大核心 CSTPCD CSCD CA CBST
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摘要:"严重急性呼吸道综合征"(SARS)由于危害严重,引起人们的高度重视,在各国科研人员努力下,目前已完成了十几个毒株的分离与全基因组测序工作.本研究对世界各地分离的SARS毒株的基因组全序列进行比较,发现不同毒株的同源性在99.8%以上,SARS病毒的遗传稳定性较高;将SARS病毒与其它冠状病毒基因组以及编码蛋白质序列进行比较分析,证实SARS病毒是一种新的冠状病毒,可能进化起源较早,并发现SARS病毒和牛冠状病毒同源程度最高.SARS病毒orf1ab、orf1a、S、M、N编码区氨基酸序列和牛冠状病毒同源程度最高,鼠肝炎病毒次之....
摘要:伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科,基因组为线状双链DNA,长约150kb,至少可编码70~100种蛋白质.根据伪狂犬病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因(Immediateearly gene),早期基因(Early gene)和晚期基因(Late gene),这三类基因依此以级联方式调节[1].第一个被转录的基因是立即早期基因,它的转录即使在细胞蛋白质合成被放线菌酮(Cycloheximide)抑制的情况下也能进行....
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北大核心 CSTPCD AJ CA CBST
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摘要:从伪狂犬病毒(PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gl基因,序列分析结果表明,gl基因编码区全长1101bp,可编码366个氨基酸残基,二级结构预测具有典型Ⅰ型膜蛋白特征.与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现,Ea株gl在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变,致使gl基因的读码框架后移,从而导致Ea株gl较rice株长16个氨基酸残基.将gl基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中的人巨细胞病毒早期启动子下游,构建的真核表达质粒转染PK-15细胞,间接免疫荧光检测证实gl获得正确表达.进一步测定天然缺失gl的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位(pfu)和组织细胞培养半数感染量(TCID5o),结果显示:Bartha株在表达gl细胞系中的pfu和TCID5o分别为对照细胞系的164%和200%.说明gl具有促进病毒增殖的功能. ...
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北大核心 CSTPCD AJ CA CBST
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摘要:以伪狂犬病病毒Ea株为模板,通过PCR扩增含gE基因主要抗原表位区的801 bp的片段,扩增产物酶切后克隆于pBluescript Ⅱ SK+中,双脱氧末端终止法测定序列并同国外Rice株进行同源比较.将该片段插入原核表达载体pET-17b的T7噬菌体启动子下游,构建的原核表达质粒pETE804在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达.SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白Mr为38 000,并形成包涵体.Western印迹分析表明,该蛋白能与Ea株野毒高免血清发生特异性反应,但与gE缺失的Barth株高免血清不反应.上述结果说明,该原核表达产物不仅具有生物学活性,而且可作为鉴别诊断的抗原....
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