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[期刊论文] 罗琪 陈劲春
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北大核心 CSTPCD CSCD CA
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摘要:考察了大肠杆菌E.coli表达的重组人干扰素α2b和胸腺肽α1融合蛋白包涵体的变性、复性及融合蛋白的分离纯化过程.实验结果表明:包涵体经7mol/L盐酸胍,10mmol/l DDT变性;1 mol/L尿素.2mmol/L还原型谷胱甘肽,O.2mmol/L氧化型谷胱甘肽脉冲加样稀释复性;金属螯合层析收集0.3mol/L咪唑洗脱峰,冷干后经重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G-50柱纯化.可得到纯度达90%的重组人干扰素口α2b和胸腺肽口α1融合蛋白,且最终目的融合蛋白产量达68mg/g干菌体....
[硕士论文] 罗琪
制药工程 北京化工大学 2008(学位年度)
摘要:干扰素α<,2b>(IFNa<,2b>)是一种抗病毒、抗肿瘤药物,并且具有免疫调节活性。胸腺肽a<,1>(THYa<,1>)具有促进体内细胞因子的分泌及淋巴细胞功能的作用,是一种细胞免疫增强剂。重组细胞因子作为免疫调节剂具有抗病毒、抗肿瘤和增强疫苗免疫效果的作用,在抗肿瘤、抗感染等治疗中取得良好疗效。多细胞因子协同作用具有明显强于单一细胞因子作用的效果。本课题利用分子生物学技术将干扰素IFNa-2b和THYa<,1>组成新型重组融合蛋白,可以优化药物的特性、提高药物的使用价值,在治疗疾病方面取得更大的成果,在医学上有较大的使用前景。 本文考察了基因工程菌的生长周期,优化了发酵条件:37℃,Kna浓度为30mg.L<'-1>发酵液,IPTG浓度为0.5mmol·L<'-1>,培养3h后进行诱导,诱导4h结束发酵,融合蛋白表达量最高,可得到精制包涵体2.5g.L<'-1>。重组蛋白质在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体,必须经过体外变性、复性的过程。通过多种变性复性方法的对比,得出变性复性的最佳条件:10mmo·L<'-1>l DTT,7mol·L<'-1>盐酸胍搅拌48h溶解包涵体变性;采用脉冲加样的操作方式按1:10将变性液加入到含有1 mol·L<'-1>尿素、0.2mmol·L<'-1> GSSG-2mmol·L<'-1>GSH的复性液中,每间隔2小时加入1mL变性液进行复性。本实验还考察了目标蛋白分离纯化的最佳方法:包涵体变性复性后引入金属螯合层析和阳离子交换层析联用进行纯化、重组肠激酶30℃酶切24h、Sephadex G-50柱除盐纯化后,最终目的融合蛋白产量达68mg.L<'-1>发酵液。电泳结果及酶联质谱显示融合蛋白表达正确。 实验结果证明重组人干扰素α<,2b>和胸腺肽α<,1>融合蛋白的分子设计合理,基因工程菌构建成功。本实验打通了一条从菌种表达直至融合蛋白分离纯化的工艺路线。为进一步研究利用基因工程菌表达重组融合蛋白及纯化提供了理论参考。
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