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摘要:利用分子克隆技术和生物信息学方法,对獭兔CREB1基因编码区序列(coding sequence,CDS)进行克隆和生物信息学特征分析,同时比较其在不同毛色獭兔的皮肤组织中的表达水平差异.结果表明,CREB1基因CDS长984 bp,共编码327个氨基酸,在不同的哺乳动物中具有较高的同源性,系统进化情况与其亲缘关系远近一致.经Hopfield、Swiss-model等预测发现,CREB1基因编码蛋白为亲水蛋白质,其二级结构包含α螺旋(h)33.33%、无规则卷曲(c)44.95%、延伸链(e)21.71%;三级结构为1条简单的螺旋链.荧光定量PCR结果显示,CREB1基因在黑色獭兔和青紫蓝色獭兔皮肤组织中的表达量极显著高于白色獭兔(P<0.01),且在黑色獭兔中表达量最高.该结果为进一步探索CREB1基因在哺乳动物毛色形成过程中的功能奠定了基础....
摘要:[目的]对家兔Myh7基因进行生物信息学分析及表达规律研究.[方法]利用RT-PCR技术检测了Myh7在肌肉发育过程中的表达规律,并结合生物信息学方法对家兔Myh7的序列进行深入分析.[结果]Myh7蛋白为不稳定亲水性蛋白,有Myosin_N和MYSc_class_Ⅱ这2个结构区域,其中MYSc class Ⅱ是肌球蛋白重链家族特有结构域.MEGA软件分析家兔Myh7分子进化,发现其与人、猩猩等物种间同源性较高,与其亲缘关系的远近一致.定量分析显示:在整个肌肉发育过程中,Mhy7表达量在腿肌中基本维持在较低水平,在背肌中的表达量相对波动较大,而在11周龄时出现表达量上升的趋势.[结论]该研究为进一步研究Myh7基因在肌肉生长过程中的功能奠定了分子基础,为研究家兔的肌肉发育分子机制提供了一定的参考依据....
摘要:选取我国地方品种福建黄兔为研究对象,利用冰冻切片技术对不同发育阶段福建黄兔背肌和腿肌的肌纤维性状进行研究,通过荧光定量聚合酶链式反应技术分析在肌肉发育过程中起重要作用的Myh6基因在福建黄兔不同发育阶段表达水平的差异,并与肌纤维性状进行相关性分析.结果显示:2、4、6、8、10和12周龄福建黄兔的白肌纤维密度均显著大于红肌纤维和中间型肌纤维,白肌纤维的面积显著高于红肌纤维,长径和短径的大小排列为白肌纤维>中间型肌纤维>红肌纤维,但差异无统计学意义;在6周龄前,背肌和腿肌中各类肌纤维长径、短径和面积呈显著增大的趋势,而6周龄后增大趋势逐渐变缓;Myh6基因在公母兔背部和腿部的表达均呈先上升后下降的趋势,其中母兔在4周龄表达量最高,公兔在6周龄表达量最高;Myh6基因的表达量与肌纤维面积、长径和短径的变化一致.表明Myh6基因与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关....
[硕士论文] 穆琳
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(Solute carrier family7member11,Slc7a11)属于溶质转运第7家族的第11个成员,编码胱氨酸/谷氨酸xCT运载体,控制褐黑色素合成从而影响真黑色素与总黑色素的比例,改变动物的毛色和肤色。课题组前期研究中,发现Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮肤中表达存在显著差异,推测其可能参与到獭兔皮毛色素沉积过程。为了进一步探究Slc7a11在色素沉积中的分子调控机制,本研究分离并鉴定了兔黑色素细胞,利用荧光定量及Wes全自动蛋白质印迹定量分析等技术手段分析了Slc7a11在獭兔不同毛色皮肤中的表达规律,并通过双荧光素酶和EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assays)实验验证了转录因子POU2F1又名Oct-1(Octamer Transcription factor-1)对Slc7a11基因启动子的转录激活有重要的调控作用。该研究结果为拓展Slc7a11在獭兔皮毛黑色素沉积中的功能,深入解析被毛色素沉积机理提供研究基础。
  主要研究结果如下:
  1、首次分离并鉴定了兔黑色素细胞,为本研究的开展提供实验素材。采集黑色獭兔背部皮肤,利用两步酶消化法分离兔黑色素细胞,发现其呈现特有的两极树突状,且具有特殊的生长晕、折光性强。Real-time-PCR检测黑色素细胞标志基因MITF、TYR、TYRP1,发现其均有表达。利用左旋多巴(L-DOPA)染色方法对分离的黑色素细胞进行染色,发现细胞中呈现棕色或者黑色颗粒。进行S-100、TYR、TYRP1的免疫细胞化学染色,发现3种标记物在黑色素细胞内均有表达,与阴性对照相比,S-100染色显示胞质及树突呈棕色阳性着色,TYR染色细胞核内为棕黄色,TYRP1呈现浅棕着色,均为阳性,说明成功分离和鉴定了兔黑色素细胞。
  2、利用RACE和克隆技术获得Slc7a11cDNA序列,包括31bp5'UTR、1509bp的开放阅读框(ORF)和132bp3'UTRs(含poly[A]tail),提交GenBank(登录号为KY971639.1)。通过免疫组织化学法分析Slc7a11蛋白在獭兔皮肤组织中的定位,结果显示Slc7a11在表皮、毛囊毛球部、毛根鞘均有蓝色阳性反应,着色深浅不等,表达部位较广泛。利用Real-time qPCR检测Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮毛中的mRNA表达水平,发现其在蛋白黄色被毛皮肤中的表达量最高,是白色皮肤的3.7倍;利用Wes系统检测Slc7a11蛋白在各毛色皮肤组织中均有表达,但蛋白青色与蛋白黄色皮肤组织中的表达量高于其他毛色,提示Slc7a11与獭兔毛色形成相关。
  3、为进一步分析Slc7a11基因在黑色素生成过程中的作用机理,通过siRNA干扰与过表达技术,转染兔黑色素细胞,利用荧光定量PCR及Wes检测MITF、TYR等毛色相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现Slc7a11过表达或抑制时,色素生成密切相关的基因的mRNA和蛋白表达量也显著变化,mRNA和蛋白表达量呈显著正相关(P<0.05),与Slc7a11表达变化情况一致。通过酶标仪检测转染之后的黑色素细胞黑色素含量,发现Slc7a11过表达/抑制时,与对照组相比,黑色素含量增加/降低。由此得出,Slc7a11可影响TYR、MITF等色素沉积相关基因的表达,进而影响黑色素生成。
  4、为了进一步揭示Slc7a11基因的调控机制,克隆了Slc7a11起始密码子前2499bp的启动子序列,首先通过预测分析Slc7a11启动子区域内潜在的转录因子,并据此构建了10个系列缺失载体,转染RAB-9细胞,利用双荧光素酶报告系统检测发现Slc7a11启动子的核心区域为-769~-619bp,经预测发现该区域存在转录因子POU2F1结合位点。利用定点突变技术,将该结合位点进行有效突变,发现突变后Slc7a11启动子活性极显著上升(P<0.01),说明POU2F1对Slc7a11启动子活性有抑制作用。进一步利用竞争性EMSA实验,确认POU2F1蛋白可结合于Slc7a11启动子-713~-703bp区域调控Slc7a11启动子活性。
摘要:为研究亚甲基水杨酸杆菌肽对断奶仔兔血液生化指标的影响,选用35日龄同期断奶新西兰白兔300只,公母各半,分为5个处理组,每个处理3个重复,每个重复20只,分别是BMD高剂量组(H,100mg/kg)、中剂量组(M,50mg/kg)、低剂量组(L,25mg/kg)、杆菌肽锌对照组(BZ,50mg/kg)、空白对照组(C,无添加),每个重复随机抽取6只,测定血液生化指标.结果发现各剂量组血清总蛋白(TP)和葡萄糖(GLU)高于空白对照组,其中高剂量组和中剂量组显著高于空白组(P<0.05),高剂量组碱性磷酸酶(ALP)和尿素氮(UN)显著低于空白组(P<0.05);剂量组IgG显著高于空白组(P<0.05),剂量组IgM与空白对照组差异不显著(P>0.05);高剂量组、中剂量组和杆菌肽锌组TNF-α、IL-2和IL-6均显著高于空白组(P<0.05).结果表明亚甲基水杨酸杆菌肽对断奶仔兔的免疫功能起到促进作用,且中剂量组的添加剂量(50mg/kg)效果最好....
[专利] 发明专利 CN201611066353.7
扬州大学 2017-03-22
摘要:本发明涉及一种原代兔黑色素细胞的分离培养方法,该方法通过酶消化法分离兔黑色素细胞,经M254完全培养基培养后更换M254/HMGS培养基培养至汇合度达到80%~90%,再利用差速消化法去除其他细胞获得纯化的黑色素细胞。大大提高了黑色素细胞的纯度,通过细胞形态观察、L‑DOPA染色、半定量、抗S‑100免疫细胞化学染色法对培养的细胞进行鉴定,结果显示分离的原代黑色素细胞多呈树突状和细长的梭状,L‑DOPA染色呈棕黑色,RT‑PCR分析表明分离的细胞表达黑色素细胞的标志基因,S‑100染色胞质呈棕色。
摘要:为研究亚甲基水杨酸杆菌肽对断奶仔兔血液生化指标的影响,选用35 日龄同期断奶新西兰白兔300 只,公母各半,分为5 个处理组,每个处理3 个重复,每个重复20 只,分别是BMD高剂量组(H,100mg/kg)、中剂量组(M,50mg/kg)、低剂量组(L,25mg/kg)、杆菌肽锌对照组(BZ,50mg/kg)、空白对照组(C,无添加),每个重复随机抽取6 只,测定血液生化指标.结果发现各剂量组的血清总蛋白(TP)和葡萄糖(GLU)高于空白对照组,其中高剂量组和中剂量组显著高于空白组(P<0.05),高剂量组碱性磷酸酶(ALP)和尿素氮(UN)显著低于空白组(P<0.05);剂量组IgG 显著高于空白组(P<0.05),剂量组IgM 与空白对照组差异不显著(P>0.05);高剂量组、中剂量组和杆菌肽锌组TNF-α、IL-2 和IL-6 均显著高于空白组(P<0.05).结果表明亚甲基水杨酸杆菌肽对断奶仔兔的免疫功能起到促进作用,且中剂量组的添加剂量(50mg/kg)效果最好.
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