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[硕士论文] 程爱民
结构生物学 中国科学技术大学 2017(学位年度)
摘要:基因的表达调控是一个发生在多时空、多层次的精细调控过程,包括表观遗传水平和翻译水平。组蛋白的翻译后修饰是重要的表观遗传调控方式之一,涉及写入器、阅读器、擦除器的相互作用。BAP1是一种重要的泛素擦除器,可以被ASXL1激活,对H2AK119ub1去泛素化,从而拮抗PRC1的功能。ASXL1激活BAP1的机制以及BAP1定位在染色质上的机理尚不清楚。CREBBP bromodomain是一种识别H3K56ac的组蛋白乙酰化阅读器,其识别的机理、识别的环境、识别的功能也不明确。除了组蛋白翻译后修饰,核糖体RNA的加工、成熟直接关系到蛋白质翻译机器核糖体的装配,也是重要的基因表达调控方式。U3 snoRNP核心复合物对rRNA进行2'-O-methylation修饰,促进rRNA的加工和成熟。目前对真核生物的U3 snoRNP核心复合物的装配研究较少。本文从三个方面对基因表达调控过程进行探究。
  BAP1是泛素羧基末端水解酶家族唯一定位在细胞核的成员,自身具有较低的酶活。ASXL1的DEUBAD结构域能够激活BAP1,并与BAP1形成PreDUB复合物对H2AK 119ub1去泛素化。我们在大肠杆菌中尝试多种方法成功表达和纯化了BAP1与ASXL1 DEUBAD结构域的复合物,生长的晶体最高衍射分辨率为2.6埃。我们发现BAP1单独存在时趋向于寡聚状态,而被ASXL1DEUBAD结构域激活后会形成稳定的异源二聚体,与报道的胞内研究结果一致。此外,我们用GST pull-down实验发现BAP1通过CTE结合在完整的核小体上,但不能作用于核小体酸性区、核小体DNA及游离的组蛋白,解释了BAP1/ASXL1复合物定位在染色质的机制。
  U3 snoRNA属于box C/D snoRNA,起引导核糖体RNA 2'-O-methylation的作用。U3 snoRNP由U3、snu13、fibrillarin、nop56/58组成,其中fibrillarin是RNA甲基转移酶。复合物装配起始于snu 13与U3的box B/C、boxC/D,然后依次招募nop56/68和fibrillarin。我们克隆了snu 13、fibrillarin、 nop56、nop58,并表达纯化了snu13和fibrillarin。通过体外转录U3、box B/C和box C/D,用EMSA实验证实了snu13与U3的相互作用。snu13结合在U3的box B/C,亲和力为2.2μM,暗示snu 13还需要结合boxC/D以提高亲和力。此前有研究报道boxB/C自身为环(loop)结构,与snu13结合才能形成扭结(Kink-turn,K-turn)结构。我们利用RNA imino氢特殊的化学位移,发现在溶液状态下U3 box B/C也能形成K-turn结构。结合以前的研究,我们认为snu13通过构象选择机制而不是构象变化来结合U3 box B/C。
  H3K56ac是一个位于核小体核心区的乙酰化修饰,在转录、DNA复制、DNA损伤修复等过程发挥重要作用,而根据报道,CREBBP bromodomain可能是H3K56ac的阅读器,但作用机理不清楚。与徐莉同学合作,我们解析了CREBBP bromodomain与H3K56ac复合物的晶体结构。晶体结构表明,CREBBP bromodomain识别H3K56ac的方式类似于其他bromodomain与乙酰化赖氨酸的相互作用,都是通过一个疏水口袋、水介导的氢键网络和保守的天冬酰胺结合赖氨酸乙酰化侧链。有意思的是,H3αN在核小体上形成α-helix,而在CREBBP bromodomain中为伸展状态。GST pull-down实验发现,CREBBP bromodomain不能结合H3K56乙酰化的重组核小体,但是能识别H3/H4 dimer上的H3K56ac,证明了伸展状态的H3αN的确存在,与之前报道的H3/H4 tetramer上H3αN构象不均一吻合。CREBBP bromodomain能明显促进HAT结构域乙酰化H3K56。根据上述研究结果,我们提出,CREBBP bromodomain从HAT活性中心捕获H3K56乙酰化的H3/H4 dimer,促进HAT进行下一轮H3K56乙酰化,随后H3K56乙酰化的H3/H4在CAF1的帮助下参与核小体组装。
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