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[期刊论文] 李碧春 程少泽
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北大核心
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摘要:生殖细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体.对于具有这些特殊性质的生殖细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及对临床治疗不育疾病产生深远意义的影响.而雄性生殖细胞的生长发育过程的调控研究从未停止过,其中包括内源性调控因素以及外源性活性物质,其主要涉及到关键基因、信号通路等因素的调控.本文总结鸡雄性生殖细胞分化调控的研究现状与进展,阐述了关键基因对鸡雄性生殖细胞分化的影响以及鸡雄性生殖细胞生成过程中不同信号通路的调节机制,明确了参与调控的关键基因和信号通路....
摘要:为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1 EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409 bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1 EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清.间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1 EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础....
摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
[专利] 发明专利 CN201810889239.7
扬州大学 2018-12-18
摘要:本发明属于动物育种学和细胞生物学领域,具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法,包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术,能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行,可重复性强,在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。
[专利] 发明专利 CN201810916667.4
扬州大学 2018-12-07
摘要:本发明属于动物育种学和细胞生物学领域,涉及一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法,包括如下步骤:Stra8基因3’UTR序列的获得;Stra8基因靶向miRNA预测;最佳miRNA筛选;验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用;体内验证miRNA对公鸡生精的影响。相对于现有技术,本发明本方法简单易行,可重复性强,在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证Stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对Stra8基因进行抑制,以便更好在SSC中进行基因功能验证。
[硕士论文] 程少泽
特种经济动物饲养 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,通过精卵结合产生新的个体。对于具有这些特殊性质的生殖干细胞,科学家们早在十年前就致力于体外培养和诱导分化成精子和卵子的研究,试图使得精子和卵子能源源不断地通过体外分化产生,这一研究一旦取得成功,将对了解生殖细胞的发生、调控机理、遗传修饰以及临床治疗不育疾病产生深远意义的影响。多年以来,对于其发生机制的研究从未停止过,其主要涉及到关键基因、生长因子等因素的调控,而随着研究的深入,lncRNA在细胞分化中发挥的重要作用逐渐被人发现。
  lncRNA作为一度被忽视的角色,越来越多的研究发现,其在生物学过程中发挥着不可替代的作用。由于lncRNA在表观遗传、转录水平参与调控许多生理过程中的作用,已得到较为深刻的认知,但对生殖细胞分化的调控研究相对较少。本研究通过单细胞的高通量测序方法检测了鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)、精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)、成纤维细胞(CEFs)四种细胞的lncRNA表达模式,通过对结果的比较分析,发现胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化这一个复杂的过程中有众多的lncRNA参与其中。而PGCs作为生殖细胞的祖细胞,对其调控的研究具有重要的意义。多年以来,对于PGCs发生机制的研究一直是人们关注的热点,其中主要集中在一些内源性调控因素以及外源性活性物质,而lncRNA在PGCs的发生过程中所扮演怎样的角色,还少有报道,本研究筛选出其中在PGCs中特异高表达的lncRNA,TCONS_00948124,在ESCs和SSCs中低表达,推测该lncRNA可能参与了PGCs的发育调控,将其命名为PGClnc1。
  为了系统地研究PGClnc1的功能与机制,本研究通过对PGClnc1进行功能性获得和缺失,旨在探索其在PGCs形成过程中的功能及其参与转录水平的调控因素;利用RNA-PullDown,质谱分析等技术探究与其互作的蛋白及其调节方式,以及探究PGClnc1与cis预测的靶基因BTRC,两者与miRNA之间的ceRNA竞争机制:为阐明PGClnc1在PGCs形成过程中的分子调控机制提供基础依据。
  研究结果如下:
  (1)ESCs向PGCs和SSCs分化过程的IncRNA单细胞测序分析收集鸡的ESCs、PGCs、SSCs、CEFs细胞,提取RNA,进行RNA-seq,筛选出参与胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞(PGCs、SSCs)分化过程的差异lncRNA,其中8个lncRNA与ESCs对PGC组的表达变化超过10倍,而在ESCs与SSCs组中的4个lncRNA和PGCs与SSCs组的1个相关lncRNA表达变化超过10倍,包括STRA8,WDR91,WNT7A,PTPDC1,BARX1等。对DELs进行GO功能注释表明,超过75%的DELs富集于生物过程,包括细胞因子刺激反应、分化;超过15%DELs富集在分子功能,与miRNA、双链DNA结合有关;而超过8%的DELs富集于细胞成分,与细胞膜表面、细胞器子室相关。DELs的KEGG通路富集分析,20个信号通路显着富集于三组中,包括Jak-STAT signaling pathway和细胞因子。细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、叶酸生物合成(Folate biosynthesis)、TGF-beta signaling pathway、Wnt signaling pathway和mTOR signaling pathway、内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、嘌呤代谢(Purine metabolism)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)和Hedgehog signaling pathway等。在这些信号通路中,DELs主要包括ENSGALG00000002005、ENSGALG00000005733、ENSGALG00000002403、ENSGALG00000001967、ENSGALG00000003339、ENSGALG00000006431、ENSGALG00000006794等。荧光定量PCR检测结果显示这些lncRNA的表达量与RNA-seq结果相一致。
  (2)PGClnc1的筛选与鉴定对筛选获得的差异lncRNA进行分析后发现,在ESCs vs PGCs、ESCs vs SSCs和PGCs vs SSCs组分别有354,654和239个特异novel lncRNA;且共有367个特异表达lncRANA参与生殖细胞分化,其中包括ENSGALG0000000038,ENSGALG0000015297,ENSGALG0000011415等;KEGG通路富集结果表明XLOC_612989(ACVR2A)、XLOC_478357(Lef-1)、XLOC_225283(MAPK1)等lncRNA能够显著的富集于18条参与雄性生殖细胞分化的关键信号通路,如TGF-β,Notch和Jak-STAT等信号通路;其中PGCs特异表达的lncRN(TCONS_00948124)显著富集于TGF-βsignaling pathway,命名为PGClnc1;表达谱检测结果表明:PGClnc1在性腺中高表达,且主要表达于细胞质中,扩增PGClnc1的4个开放阅读框(ORF2、ORF3、ORF6、ORF8),连接带有his标签的原核融合表达载体pET28a(+)载体,经IPTG诱导细菌蛋白进行Western Blot检测,发现PGClnc1的ORF2可诱导表达his标签蛋白,进而确定PGClnc1具有编码小肽的能力。
  (3)启动子调节PGClnc1差异表达结合NCBI和UCSC数据库,确定PGClnc1转录起始位点上游1500bp左右的序列为PGClncq1启动子并克隆,置换扩增pEGFP-N1载体中的CMV启动子,将重组载体pPGClnc1-EGFP进行体外转染DF-1细胞,绿色荧光能够正常表达,说明克隆的PGClnc1启动子区域具有活性;通过缺失片段克隆技术,构建PGClnc1启动子不同缺失片段载体PGL3-P1~PGL3-P6,并通过双荧光素酶报告系统检测发现PGClnc1启动子核心区域为-1033~-661bp;PGClnc1启动子核心区域存在STAT1、TCF7L2、Sox2转录因子结合位点,对这些位点进行点突变实验同时构建相应转录因子点突变载体,通过双荧光素报告系统检测发现这些转录因子对启动子的活性都有一定的正向调控作用,其中TCF7L2作用极显著;利用5-Azadc(10μmol/L)、TSA(1μmol/L)处理转染P GL3-P1的DF-1细胞,发现DNA甲基化抑制剂5-Azadc以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,PGClnc1启动子活性由8.36±3.33上升至68.99±2.29、141.7±3.12,表明降低DNA甲基化水平和提高组蛋白乙酰化水平能够提高PGClnc1启动子活性。
  (4)PGCInc1在PGCs形成过程中的功能针对PGClnc1序列设计3个shRNA靶位点,构建慢病毒干扰载体,并进行慢病毒包裹,以qRT-PCR检测慢病毒干扰载体的干扰效率。成功构建干扰载体PGClnc1-sh1、PGClnc1-sh2和PGClnc1-sh3,干扰效率分别为29%±0.04、77%±0.02和47%±0.05(P<0.01),通过体内和体外两个水平研究PGClnc1在PGCs形成过程中的功能,结果显示:体外实验过程中,在过表达组诱导4天后能出现生殖样细胞,且生殖标记基因有显著性的上调表达,敲除组在相同的情况下则不能。流式细胞分选结果表明,在第4d,正常诱导分化的细胞中类PGCs样细胞所占比例为4.5%±0.19,而在过表达PGClnc1后,比例上升至5.9%±0.21(P<0.01),相对地,敲低PGClnc1后,比例显著下降至1.1%±0.2(P<0.01)。荧光定量实验结果也显示PGClnc1敲低后PGCs的标记基因cvh的表达(0.3412±0.03)与正常组(1.02454±0.03)相比出现了显著的下调(P<0.01);间接免疫荧光结果显示,相对于RA诱导组,过表达PGClnc1后CVH蛋白表达增加,而在敲低PGClnc1后,CVH蛋白表达却显著下降;体内实验过程中,鸡胚注射慢病毒载体10μL106TU/mL+90μL DMEM,注射后能够稳定表达EGFP且鸡胚能够激发绿色荧光。qRT-PCR结果显示在敲低PGClnc1后,cvh、c-kit生殖相关基因大幅度下降到0.245±0.199、0.17±0.0458,过表达PGClnc1,体内各个基因的表达量发生了相反的变化,其中cvh、c-kit大幅上升至0.67±0.02、0.85±0.01(P<0.05);PAS结果显示敲低PGClnc1能够显著降低PGCs的产生。流式细胞分选结果显示,在control组中cvh阳性细胞率所占比例为4.2%±0.21,而在过表达PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例上升至5.8%±0.15(P<0.01),相对地,敲低PGClnc1后,cvh阳性细胞率所占比例下降至1%±0.19(P<0.01)。
摘要:前言Cas9介导的基因编辑工具已经广泛的用于人、小鼠、斑马鱼等物种,而且在植物上也有广泛的应用,但是该方法在家禽中的应用尚未见报道。自1997年以来,本实验室一直致力于鸡的胚胎发育和鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的调控机制研究,已经完成鸡雄性生殖细胞发育分化过程中的转录组测序筛选到参与鸡雄性生殖细胞生成的关键基因和信号通路。为了进一步验证这些关键基因和信号通路的功能,在家鸡中建立有效的体外基因编辑系统就显得尤为迫切和必要。
摘要:[目的]本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目基因的定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。[方法]基于NCBI 数据库提供的CDS 序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC,C2EIP)基因全长,并根据基因序列中APM 的位置设计特异性gRNA1,gRNA2 和gRNA3 并构建cas9/gRNA 载体;将设计好的cas9/gRNA 转染状态良好的DF-1,利用luciferase SSA 重组检测法、T7E1 酶切法以及TA 克隆测序法检测gRNA 在DF-1 细胞中基因的敲除效率。
摘要:本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SSC 诱导分化体系提供新的依据。以RNA-Seq 技术对鸡ESC、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和SSC进行测序与分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的候选lncRNAs,以qRT-PCR 对候选lncRNAs在三种细胞中表达趋势变化进行验证,通过BLAST 和RNAplex 软件对候选lncRNAs 进行靶基因预测,同时以DAVID 数据库、WEGO 以及STRING 等在线软件进行功能和蛋白网络互作分析。
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