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摘要:目的 建立快速检测实验大鼠冠状病毒和仙台病毒的双重PCR方法.方法 根据大鼠冠状病毒N基因、仙台病毒L基因设计特异性引物;经过双重PCR优化,特异性和敏感性的检测,建立双重PCR体系.应用该PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本和实验动物组织样本,并与ELISA方法比对.结果 双重PCR扩增出大鼠冠状病毒(168 bp)和仙台病毒(262 bp)目的条带,PCR扩增产物测序结果利用核酸BLAST功能进行同源序列对比,仙台病毒和大鼠冠状病毒同源性分别为100%和99%.仙台病毒和大鼠冠状病毒的检测下限为1.56×102 copies/μL.特异性检测对小鼠肝炎病毒扩增,产生片段大小近似大鼠冠状病毒产物.应用建立的双重PCR体系检测人工感染仙台病毒组织DNA样本,30份DNA标本均被检出;检测94份实验动物肺组织样本,结果均阴性.结论 建立的双重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对实验动物仙台病毒和大鼠冠状病毒病原体的快速检测....
摘要:目的 建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法.方法 根据GenBank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系.应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比.结果 多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带.肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带.应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本.结论 本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测....
摘要:泰泽氏菌、肺支原体、兔出血症病毒是实验动物重要的致病病原体,可引起呼吸系统、消化系统疾病,对动物的生产和动物实验可产生不良影响.本文对上述国家检测标准规定必须检测且有检测难度的三种病原体进行方法学总结,以获得更好特异性和敏感性的诊断方法;提出传统方法初检、PCR方法复检的方法以提高检测结果的准确性和可靠性....
摘要:目的 建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌多重PCR检测方法,为实验动物细菌检测提供快速、灵敏、简便的方法.方法 根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌LasI基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因和细菌通用16S rRNA基因设计出特异性引物;经过多重PCR引物浓度和退火温度的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系.应用该PCR体系对人工感染标本、实验动物粪便样本进行验证检测,与传统检测方法对比.结果 多重PCR分别扩增出金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)和通用(520 bp)的目的条带.多重敏感性为10 pg,特异性检测未从其他细菌中检测出目的条带.应用建立的多重PCR体系检测出不同组合的人工感染标本,从76只粪便检测出绿脓杆菌阳性1例,与传统检测方法结果一致.结论 本文建立的多重PCR方法具有特异、灵敏、简便、快速等优点,为实验动物微生物的快速检测提供了可靠的方法....
[专利] 发明专利 CN201611110727.0
河北医科大学 2017-03-22
摘要:本发明公开了一种同时检测多种病原体的五重PCR检测方法。首先筛选出具有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌和肺支原体的保守性序列的基因,作为PCR检测的靶点,分别合成扩增对应保守序列的特异性引物,将5对引物同时放在一个PCR反应体系中,通过各项优化,建立直接从样本中一次性检测五种病原体的五重PCR检测方法。较常规的PCR检测方法,本发明的检测方法具有快速、灵敏、简便、准确的特点,降低了对检测人员的要求和检测成本。
摘要:目的 探讨染色体数目、结构和多态性异常与不孕不育临床表现的关系.方法 按照常规G显带方法制备外周血淋巴细胞染色体,并对其核型进行数目和结构的分析,必要的做C显带和Y染色体微缺失.结果 7658例不孕不育病例中251染色体核型异常,异常率为3.28%,其中数目异常93例,结构异常158例,比例分别为1.22%、2.06%,染色体多态性630例,比例为8.23%.结论 细胞学遗传学对于不孕不育患者在优生优育中具有指导意义....
[硕士论文] 祝岩波
动物学 河北医科大学 2017(学位年度)
摘要:目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物作为人类的替身承担药物安全和治疗效果,其质量直接影响众多领域科学实验的准确性。随着我国科研水平的不断提高,研究人员对实验动物的微生物质量控制要求越来越严格。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺支原体(Mycoplasma pneumoniae)、泰泽氏菌(clostridium piliformis)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)等七种病原体是我国实验动物微生物质量控制需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体。
  目前对实验动物携带的病原体主要依靠分离纯化培养、菌落形态、镜下观察及生化试验等方法进行鉴定,检测周期长,费用高,并且需要有经验的检测人员进行判定,漏检、误判时有发生。PCR(Polymerase Chain Reaction)技术以其简便、快速、准确等优点已广泛用于医疗和卫生行业,但实验动物的微生物质量控制还未将PCR检测方法纳入,更没有多重PCR方法,这已成为多种病原体或大样本简单、快速、准确鉴定的掣肘。
  多重PCR(multiplex PCR)可以在同一反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高效等优点。用于实验动物病原微生物检测,可以同时检测多种病原体,适合大样本的检测与鉴定,具有高灵敏性、高特异性和低成本等优点。多重PCR在其他行业应用较多,然而,目前应用在实验动物病原微生物检测的研究很少。
  本研究目的是针对七种实验动物病原菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌、肺炎克雷伯杆菌,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法或血清学方法比较,验证多重PCR检测方法的可操作性和准确性。
  方法:
  1、标准菌株的培养和DNA提取:将金黄色葡萄球菌标准株接种到SP琼脂培养基,绿脓杆菌标准株接种到NAC琼脂培养基,肺炎克雷伯杆菌接种到DHL琼脂培养基,37℃培养18-24h;多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌接种到血琼脂培养基,37℃培养24-48h;肺支原体接种到液体培养基中,一周后进行观察收集。按照细菌提取试剂盒方法提取各种病原体的DNA,泰泽氏菌DNA由中国食品药品检定研究院惠赠。
  2、引物的设计:通过查阅文献和Primer5.0软件设计金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌的特异性引物,使用Blast分析引物特异性;进行PCR扩增,测序鉴定。
  3、特异性实验和敏感性实验:PCR扩增非目的菌进行特异性实验;将模板DNA按照10倍的比例进行梯度稀释,检测PCR敏感性。
  4、四组多重PCR检测方法的建立和初步应用
  4.1.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺炎克雷伯杆菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,同时加入16S rRNA的引物作为内质控,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性。应用该多重反应体系检测人工感染的粪便样本和76例新鲜大、小鼠粪便样本,同时采用传统检测方法进行检测。
  4.2.将多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体三种病原微生物在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  4.3.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌和肺支原体五种病原微生物在同一个反应体系中扩增,优化多重反应体系和扩增条件,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系,应用该多重反应体系检测人工感染病原菌的粪便、气管分泌物、棉拭子和182例实验动物样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  4.4.将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和泰泽氏菌三种细菌在同一个反应体系中扩增,验证该多重体系的特异性和敏感性,建立多重反应体系。应用该多重反应体系检测112例实验动物粪便样本,同时采用传统检测方法或血清学方法进行检测。
  结果:
  1、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌在琼脂培养基上生长,肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。
  2、获得10对特异性引物,并通过Blast比对验证引物的特异性,扩增产物大小分别为金黄色葡萄球菌(153 bp)、绿脓杆菌(600 bp)、肺炎克雷伯杆菌(368 bp)、通用引物(520 bp)、多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、肺支原体(266 bp)、泰泽氏菌(639 bp)、绿脓杆菌(197 bp),扩增产物测序结果均与Genebank中相应序列一致。
  3、PCR特异性和敏感性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体和泰泽氏菌特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性。敏感性实验:金黄色葡萄球菌DNA检测最低限为1pg;绿脓杆菌DNA检测最低限为10pg;肺炎克雷伯杆菌DNA检测最低限为10pg;多杀巴氏杆菌DNA检测最低限为1pg;支气管鲍特杆菌DNA检测最低限为10pg;肺支原体DNA检测最低限为1pg;泰泽氏菌DNA检测最低限为100 pg,对应的拷贝数600 copies/μL。
  4、四组多重PCR检测方法:
  4.1.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、肺炎克雷伯杆菌(368bp)和16S rRNA(520bp)的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测人工感染病原菌样本,检测结果均阳性;76份大、小鼠粪便样本多重PCR检测结果显示1份小鼠粪便样本绿脓杆菌阳性,其余样本检测阴性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR检测结果一致。
  4.2.建立多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)、肺支原体(266bp)的多重PCR检测方法;应用多重PCR方法检测人工感染的气管分泌物、棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔棉拭子样本多重PCR检测结果19例兔棉拭子样本多杀巴氏杆菌阳性,9例大鼠棉拭子肺支原体阳性;多杀巴氏杆菌和支气管鲍特杆菌传统培养检测方法检测结果全部阴性,肺支原体血清学方法检测9例阳性。
  4.3.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(600bp)、多杀巴氏杆菌(356bp)、支气管鲍特杆菌(237bp)和肺支原体(266bp)的多重PCR检测方法;应用多重PCR方法检测人工感染的粪便、气管分泌物和棉拭子样本,检测结果均阳性;182例大小鼠、兔粪便和棉拭子样本多重PCR检测结果1例小鼠粪便绿脓杆菌阳性;传统培养检测方法检测结果与多重PCR结果一致,肺支原体血清学方法检测肺支原体全部阴性。
  4.4.建立金黄色葡萄球菌(153bp)、绿脓杆菌(197bp)和泰泽氏菌(639bp)的多重PCR检测方法。应用多重PCR方法检测112例大小鼠、兔粪便样本检测结果全部阴性,传统培养鉴定方法检测金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌结果阴性,血清学方法检测泰泽氏菌全部阴性。
  结论:
  针对七种病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺支原体、泰泽氏菌和肺炎克雷伯杆菌,根据病原菌特点和检测取材方法,分别建立了四组多重PCR检测方法。四种组合均有良好的敏感性和特异性,人工感染的样本均检测结果阳性。多重PCR检测方法的初步应用显示,多重PCR具有良好的可操作性和准确性,检测结果与传统培养或血清学检测方法一致,有些样本传统培养方法或血清学检测方法未检测出的,但多重PCR体系检测出阳性结果。本方法的建立为今后多重PCR应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。
摘要:目的 比较分离培养与PCR 方法鉴定实验动物金黄色葡萄球菌和绿脓杆的异同.方法 采用传统分离培养的方法对35 只大小鼠金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌进行检测;提取SP 和NAC 平板24h 培养物核酸进行PCR 检测.结果 分离培养法检出4 只金黄色葡萄球菌阳性,8 只绿脓杆菌阳性.PCR 鉴定出4 只金黄色葡萄球菌阳性,15 只绿脓杆菌阳性.结论 PCR 方法不仅快速、准确,可防止漏检、误判.
摘要:目的:观察ube2c基因在斑马鱼胚胎发育不同时间点的表达规律,以便今后对其功能作用进行进一步的研究. 方法:选择受精后0小时(hour post fertilization,hpf)、2hpf、4hpf、8hpf、12 hpf、24hpf、48hpf、72hpf及7dpf(day post fertilization,dpf)的斑马鱼鱼卵,提取RNA、反转录后进行Real-Time PCR对ube2c在不同时间段的表达进行检测;通过合成的地高辛标记反义ube2c RNA探针,对以上各时间段胚胎进行整胚原位杂交,观察ube2c在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达规律. 结果:Real-TimePCR结果显示,发现ube2c在0hpf(1-cell)即有表达,4hpf(囊胚期)其表达最高,在孵化期(48hpf)之后则降低到较低水平.整胚原位杂交显示,0hpf即可检测到ube2c的表达信号,并集中在胚盘处;从卵裂期(0.75-2.25hpf)直到12hpf,ube2c均呈广泛性分布;24 hpf开始,表达信号呈现一定组织特异性,在48hpf之后,信号主要集中耳囊、肝、生殖系等处. 结论:斑马鱼ube2c的表达具有明显的母源表达特征,推测其可能通过参与母源蛋白的泛素化降解来调控胚胎的发育,其在耳囊、肝、生殖系等组织器官的特异性表达也为UBE2C在胚胎发育中的功能研究提供了研究方向,对胚胎发育过程的研究对了解相关肿瘤的发生发展机制具有重要指导作用。
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