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[硕士论文] 申清湄
生物化学与分子生物学 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是一种非常抗旱、抗寒、耐盐碱、耐贫瘠的豆科牧草,是高寒地区人工牧草种植和天然草地改良的理想牧草,是苜蓿抗性育种不可或缺的种质资源。因此,从中挖掘抗寒基因,揭示抗寒机制具有重要意义。本研究以黄花苜蓿和抗寒性较差的柱花草(Stylosanthes guianensis)为材料,参照黄花苜蓿和截型苜蓿低温响应基因表达谱,从黄花苜蓿中克隆了一个响应低温显著上调表达的未知功能基因MfCML24,获得过表达MfCML24的转基因柱花草,分析它们的表型及抗冷性,初步探讨该基因的功能。主要研究结果如下:
  采用定量RT-PCR方法,分析了MfCML24的时空表达特征,结果表明MfCML24在叶片当中的表达量最高,其次为叶柄,在茎和根中的表达量最低,大约只有叶片表达量的1/5左右。分析了黄花苜蓿和截型苜蓿叶片中CML24基因响应低温的动态变化,结果显示,低温处理1 h后MfCML24开始受到诱导,4h达到最大,而MtCML24基因不受低温诱导。对MfCML24、MtCML24基因的启动子序列的顺式作用元件进行比对,发现MfCML24启动子序列中除包含基本的启动子元件及大量的CAAT盒(与增强转录效率有关)外,还包含低温响应元件LTR、生长素、水杨酸和茉莉酸等植物生长激素、病原菌和盐诱导元件等,而MtCML24启动子中没有低温响应元件LTR。根据LTR元件的位置和5’端缺失法的原理,设计特异引物ZG1313、ZG1314和ZG5232将MfCML24基因启动子截成距离转录起始位点-220 bp、-926 bp和-200 bp三段,其中ZG5232引物将低温响应元件LTR换成非顺式作用元件。分别构建了它们调控GUS基因表达的载体,并获得了两株携带MfCML24p(200 bp)调控GUS基因表达载体的T1代转基因拟南芥。在线预测MfCML24蛋白是定位在细胞核上,通过MfCML24-GFP融合蛋白在水稻原生质体细胞的瞬时表达,确定MfCML24蛋白在细胞质和细胞核都有表达。
  将MfCML24完整编码区装载到带35S启动子的表达载体pZG103.1上,构建过表达载体。农杆菌介导法将过表达载体转化柱花草,从11个抗性愈伤组织中获得了转基因柱花草。通过PCR证明MfCML24基因和Bar基因已经整合到转基因柱花草基因组中;采用实时荧光定量PCR检测,表明MfCML24基因获得了表达。对过表达MfCML24基因柱花草T1代幼苗进行Basta抗性筛选,野生型植株全部死亡,转基因柱花草部分死亡。进一步检测了转基因柱花草的抗冷性,低温(8℃)处理6 d后,测定最大光化学效率(Fv/Fm)和相对电导率。低温处理后转基因柱花草Fv/Fm高于野生型,而相对电导率低于野生型,表明转基因植株的抗冷性高于野生型。
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