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摘要:目的 探讨p53基因第72位密码子单核苷酸多态性,并分析该多态性位点与病理性瘢痕的相关性.方法 常规抽取105例瘢痕患者和190例健康志愿者的血液,提取DNA,设计1对针对p53基因第4外显子第72密码子单核苷酸多态性荧光探针,进行实时定量PCR分析并观察图像.结果 实时定量PCR技术检测能准确区分各种基因型,抽取295例血液样品中,基因型CCC有121例,基因型CGC有88例,基因型CCC/CGC有86例,通过PCR荧光分子信标检测p53基因第72密码子单核苷酸多态性的方法.CCC基因型患病理性瘢痕的概率最高,病理性瘢痕患者的年龄及发病部位与基因型有无相关性尚待进一步研究.结论 CCC基因型及单核苷酸多态性可能与病理性瘢痕形成相关....
[硕士论文] 田郭军
细胞生物学 南方医科大学 2013(学位年度)
摘要:人的皮肤作为最大的器官担负着保护人体内部结构和各大脏器系统的重要功能,同时也在细胞代谢和生长增殖等生理过程发挥着调节作用。瘢痕是一种创伤愈合的结果,瘢痕在过度增生等情况下,引起机体不适或造成畸形及功能障碍时,被认为是病理现象,称之为病理性瘢痕。病理性瘢痕是基因的表达发生变化,从而影响到碱基的转换。瘢痕具有独特的生长特性及临床表现,其增殖-凋亡失衡时导致不断增生而且难以退化的细胞学基础。P53基因与其有密切的关系。瘢痕就细胞学而言是细胞过度增生性病变,是指皮肤损伤后,成纤维细胞活性异常增高,结缔组织过度增殖和透明变性而引起的。近年来国内外许多学者在分子基因水平对病理性瘢痕形成某些机制进行了研究,不少学者认为成纤维细胞的p53基因的异常表达是病理性瘢痕形成的重要原因之一。
   临床瘢痕主要分为增生性瘢痕和病理性瘢痕二种。由于增生性瘢痕与病理性瘢痕在临床表现上相似,以往人们很易混淆两种疾病的概念。现在的研究已证实,增生性瘢痕的基本过程为机体自身过度修复的结果,多半是局部性生长,病理性瘢痕临床表现除了具有一般瘢痕的特性外,还有着“肿瘤样生长”倾向、病变超出原损伤区、有特殊的高发部位、皮肤损伤可逐渐增大、病程长、无自行萎缩倾向、自觉瘙痒、刺痛和知觉减退、单纯手术切除后极易复发等特点,病变不超出原损伤区,增生可以自限,但病程时间亦较长。
   病理性瘢痕的主要病理表现为成纤维细胞活性异常增多,结缔组织不断增殖和透明变性,瘢痕组织内胶原及基质成分的大量沉积,精确的发病机制迄今未明。临床上因外伤、感染、手术、烧伤、烫伤或机械性刺激,或一些非常轻微的损伤(如穿耳、注射或暗疮破溃)或无明显的诱因,均可导致病理性瘢痕。病理性瘢痕形态可呈条状、圆形、椭圆形或不规则形的坚硬扁平隆起,暗红色、表面光滑发亮、无毛发。青壮年多发,好发于头面部的耳垂、下颌,胸腹部的前胸、四肢的外侧以及女性剖腹产伤口的耻骨联合部等特殊部位。
   在暴露部位的病理性瘢痕影响美观,造成容貌破损等,给患者带来不适和痛苦,造成严重的心理负担。病理性瘢痕是目前整形外科的常见病,人们尝试用不同的方法来治疗,但遗憾的是,到目前为止无论是手术治疗还是非手术治疗,或者是联合治疗,仍然没有一种完善的治疗方案可以获得稳定又满意的疗效,给整形外科医师带来了工作上的困扰。
   病理性瘢痕难以治愈好的主要原因是该病发病机制还不十分明确。因此寻找病理性瘢痕的分子机理成为该领域的研究热点。近年来,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),特别是p53基因第72位密码子的多态性引起了人们的高度重视。如何预测和干扰病理性瘢痕的形成一直是整形外科的研究的热点。本课题组之前的研究发现瘢痕外周血淋巴细胞中p53基因外显子4第72位密码子的基因型分布存在多态性,而且这种多态性分布在普通人群及病理性瘢痕人群中存在差异。这种分布的差异为临床筛选瘢痕易感人群提供了理论依据。同时,为进一步推动研究的临床应用,并进一步研制了p53基因检测试剂盒。一种可以初步预测病理性瘢痕易感人群的检测方法。
   基因组序列的差异构成了不同个体与群体对疾病的易感性。人类基因组中存在广泛的多态性,最简单的多态性形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代,单核苷酸多态性(SNP)指在二条同源染色体上,同源DNA序列长度相等,但个别核苷酸存在个体差异。单核苷酸多态性是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,它是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,平均每500-1000个碱基对中就有一个,估计其总数可达300万个甚至更多。由于SNP具有数量多、分布广以及筛查快速等优点,所以人们普遍认为SNP是新一代的遗传标记。本研究拟在前课题组工作的基础上,进一步明确p53基因的多态性与病理性瘢痕的关系,另一方面通过构建检测p53基因的试剂盒,为筛查病理性瘢痕易感患者提供方便。
   实验的目:
   1探讨p53基因的多态性SNP位点与病理性瘢痕发病的可能关系,用荧光定量PCR方法,建立筛选人群病理性瘢痕的易感基因的检测标准。
   2研制可用于判断瘢痕高危个体的基因检测试剂盒。
   研究对象及方法:
   研究对象:一组为瘢痕组,收集临床上已知的瘢痕患者105例。另一组为健康志愿者组,收集190例。取得知情权后抽取外周静脉血样本及登记相关临床资料。
   实验方法:抽取待测人群的外周静脉血,提取全血中的DNA样本;两组均采用分子信标荧光PCR法检测P53基因codon72多态性。设计一对p53基因第4外显子的第72密码子单核苷酸多态性(SNP)荧光分子信标探针,用Fam荧光分子标记CCC,用Hex荧光分子标记CGC,在定量荧光PCR(Real-time PCR)仪检测该位点SNP,并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。根据已知p53基因72密码子SNP基因型样本的荧光定量测定结果,制定以下判别标准:以荧光强度≥本底荧光2.5倍为阳性反应。单纯MBC探针(Fam绿色荧光)阳性判定为CCC/CCC纯合子;单纯MBG探针(HEX红色荧光)阳性判定为CGC/CGC纯合子;MBC探针(Fam绿色荧光)和MBG探针(HEX红色荧光)双阳性判定为CCC/CGC杂合子。通过二种不同的荧光,显色不同结果判定待检者p53基因外显子4第72位密码子的基因型,通过比较,判断这种方法的优势。
   实验结果:
   本组实验共检测了临床瘢痕组105例及健康组190例的血样本中的p53基因codon72基因表达。瘢痕组中p53基因外显子4第72位密码子显示基因型为C/C型为78人,占总数的74.29%;显示基因型为C/G型为18人,占总数的17.14%;显示基因型为G/G型为9人,占总数的8.57%,与DNA测序结果相同。
   统计健康组的基因型分布情况为:健康组中p53基因codon72显示基因型为脯氨酸(C)/脯氨酸(C)型为43人,占总数的22.05%;显示基因型为脯氨酸(C)/精氨酸(G)型为70人,占总数的35.90%;显示基因型为精氨酸(G)/精氨酸(G)型为77人,占总数的39.69%。统计学分析,实验结果表示:临床上应用分子信标荧光PCR法对p53基因codon72多态性的检测,基因型为C/C与基因型为C/G+G/G术后发生病理性瘢痕的风险差异有统计学意义,且高于基因型为C/G+G/G的患者(P<0.01)。C/C纯合子与其他基因型相比较,与病理性瘢痕有较高的相关性,存在病理性瘢痕患病风险。
   实验结论:
   成功地建立了简单、快速和精确地分析瘢痕体质相关易感基因单核苷酸多态性的方法;这些易感基因单核苷酸多态性可能与病理性瘢痕发病相关。荧光探针标记法创新了检测p53基因的方法,准确率高,更方便快捷,可以作为预测病理性瘢痕易感人群的检测手段对判断病理性瘢痕高危个体具有指导意义。
   临床意义:
   推广和应用,为临床预测病理性瘢痕易感人群提供一种可能。试剂盒的成功研制对病理性瘢痕易感人群的筛查,有临床指导意义。为需要手术的患者预测病理性瘢痕的患病风险,提前做好瘢痕的预防性治疗,减少了心理负担。尽量减少病理性瘢痕发生的可能性。一旦检测出阳性结果,对于未发病的瘢痕易感者可以给予尽早的警示,尽量避免穿耳、挤破暗疮等不必要的损伤,降低患病风险,及时给予患者避免瘢痕增生的警示和增强易感者自我防治的意识。PCR荧光分子信标检测技术优于PCR-反向斑点杂交法,更适合临床应用,给患者带来了福音,给瘢痕体质的人们开启了另一扇窗户。检测p53基因codon72多态性SNP位点的试剂盒新方法具有检测准确、迅速、使用方便、成本不高等优点,临床上可以考虑作为检测病理性瘢痕患病风险的常规项目普及,弥补瘢痕检测项目的空缺。
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