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摘要:为了解中梅山猪生长性状的发育情况,加强中梅山猪的保种选育工作,随机挑选健康无病、体况相近的2月龄中梅山猪30头,公母各半,分别在2、4、6、8、10、12和24月龄测量体质量和体尺指标.结果表明,2月龄时中梅山公母猪体质量和体尺指标无显著性差异;2月龄之后公猪的生长发育速度开始高于母猪,公猪的大部分生长指标高于母猪,特别是在6月龄时,公猪的体长、体高、胸宽、胸围、腹围和腿围均显著或极显著高于母猪;6月龄之后中梅山猪一部分指标的差异性消失,表明公、母猪生长速度的规律并不一致;10~24月龄时公猪的体质量、体高、胸宽和管围均高于母猪,且在该时期大部分时间呈现显著或极显著差异,而胸围和腹围(12月龄的胸围除外)均极显著低于母猪.不同月龄中梅山猪体质量和体尺指标的生长增量各不相同,就2个月的绝对生长而言,8~10月龄的绝对生长量最高,为27.10 kg;10~12月龄最低,为13.65 kg.中梅山猪2~10月龄时平均日增质量(ADG)变化趋势较为平稳,8~10月龄时ADG达到最大值,之后开始下降,10~12月龄和12~24月龄时ADG均极显著下降.该试验结果为进一步开发利用中梅山猪的种质资源以及该品种的保种选育提供了基础资料和重要依据....
摘要:东串猪作为我国优良地方猪品种,测定其纯种及其与杜洛克杂交猪的生长性能、屠宰性能及血清生化指标,对于下一步的保种和开发利用具有十分重要的意义.本试验分别选取体质量约50 kg、体况相近的健康东串猪和杜洛克×东串猪(杜东猪)各32头(公母各半),换料期3d,饲养期80 d,按照猪场管理要求正常饲养,并测定生长性能、屠宰性能及血清生化指标.结果显示,杜东猪较东串猪的平均日增质量高出89.52 g,平均日采食量高出569.31 g;杜东猪的屠宰率、后腿比例和瘦肉率分别较东串猪高出9.15、2.36、3.80百分点;东串猪的谷草转氨酶、总蛋白、球蛋白和乳酸脱氢酶含量显著性高于杜东猪(P<0.05).试验结果表明,东串猪与杜洛克的杂交后代生产性能有很大的改善,但对肉质和环境适应性会有一定程度的影响.杜东猪的生长性能、屠宰性能和肉品质在中国地方猪种二元杂交猪中处于中等水平,今后还需要进一步加强东串猪的纯种选育以及杂交配套工作....
摘要:MUC4和MUC13基因作为产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coil,ETEC) F4的重要抗性候选基因,可能在断奶仔猪抗ETEC F18菌株的感染过程中发挥重要作用,因此本试验运用实时荧光定量PCR法分析了MUC4和MUC13基因在梅山猪ETEC F18抗性型和易感型个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠)中的表达水平及差异.结果显示,MUC4和MUC13基因在检测的11个组织中均有不同程度的表达.其中,在胸腺和淋巴组织中,MUC4基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05);在肺脏组织中,MUC13基因在抗性型个体中的表达水平显著高于易感型个体(P<0.05),且MUC13基因在抗性群体肠道中的表达水平较高.由此推测,MUC4基因在免疫组织、MUC13基因在肠道组织的高表达可在一定程度上提高了机体的免疫能力,保护和润滑肠道,从而抵抗ETEC F18菌株对机体的感染....
摘要:为分析CD14基因在猪各组织中的发育表达差异情况,进一步探讨该基因的免疫调控机制,实验利用实时荧光定量PCR比较分析CD14基因在7个不同发育阶段梅山猪的12个组织中的表达水平.结果表明:CD14基因在不同发育阶段梅山猪的12个组织中均有表达,且在不同阶段呈现相对一致的表达规律,在肝中呈现极高的表达水平,在脾、肺、肠系膜淋巴结等组织中呈现中等的表达水平,在其他组织中呈现较低的表达水平.发育性表达分析显示,CD14基因在肝脏中从初生到成年一直保持较高的表达水平;在免疫组织(脾、肺、肾和胸腺)、肠道组织(十二指肠、空肠和回肠)和胃组织中,CD14基因的表达水平从初生起呈上升趋势,14或21日龄表达水平最高,之后呈下降趋势并一直保持较低的表达水平,在肠系膜淋巴结中,初生仔猪CD14基因的表达水平最高,之后显著下降并维持较低的表达水平.由此推测,CD14基因的表达水平变化趋势与仔猪自身免疫发育具有相对的一致性,且与仔猪抵抗开食期和断奶期的应激有着密切的联系....
摘要:猪α-(1,2)岩藻糖转移酶2(FUT2)基因为鞘糖脂生物合成—球系列通路中的重要基因,可能在断奶仔猪抵抗大肠杆菌 F18侵染过程中发挥着调控作用。为探究猪 FUT2基因的序列结构及其生物学功能,试验采用 PCR扩增得到地方猪品种东串猪 FUT2基因的 CDS 全序列,进而预测和分析 FUT2基因的蛋白质序列及其功能区域,同时对其在8头35日龄东串断奶仔猪11个组织中的表达水平进行检测与分析。结果显示,FUT2基因的 CDS 序列全长为1023 bp,共编码340个氨基酸,FUT2蛋白为脂溶性的亲水蛋白,蛋白结构不稳定,该蛋白存在1个跨膜螺旋结构,但不存在信号肽,表明 FUT2蛋白为膜蛋白;FUT2蛋白存在2个 N-糖基化位点(185和305位氨基酸),无 O-糖基化位点,此外该蛋白还存在14个潜在的磷酸化位点,包括6个 Ser、2个 Thr 和6个 Tyr,对其功能区域进行分析发现,FUT2蛋白存在1个超级家族保守结构域:FUT1-FUT2-like(58-319位氨基酸);系统进化树结果显示,猪与牛的亲缘关系相对较近,与人、黑猩猩、大鼠和小鼠等亲缘关系相对较远;FUT2基因在东串断奶仔猪11个组织中均有表达,在消化道和免疫组织中表达水平较高。试验结果推测 FUT2基因在断奶仔猪抵抗大肠杆菌 F18中可能具有一定的作用,且可能是通过合成岩藻糖转移酶间接发挥其抵抗大肠杆菌 F18的作用。...
摘要:旨在探讨LTβR基因在苏太断奶仔猪各组织间的mRNA表达谱,并比较分析该基因在大肠杆菌F18抗性/敏感型群体间的表达差异,为进一步探讨该基因的功能及筛选断奶仔猪大肠杆菌F18抗性遗传标记提供一定的指导和依据.试验分别挑选35日龄大肠杆菌F18抗性/敏感型苏太断奶仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法比较分析LTβR基因在11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)间的表达差异.结果:LTβR基因在检测的11个组织中均有表达,其中在肝、肺、肾、胃、十二指肠和空肠呈现高水平表达,在脾和淋巴结中呈现中等水平表达,在心脏、肌肉和胸腺组织中呈现低水平表达.除肝脏外,LTβR基因在抗性型个体中表达量普遍高于敏感型个体,而且在肠系膜淋巴结中的表达量极显著高于敏感型个体(P<0.01).由此推测,LTβR基因的表达上调有利于断奶仔猪抵御大肠杆菌F18的感染,且可能是通过在淋巴结组织中的高表达维持和提高了肠道的免疫水平,从而提高了断奶仔猪抵御大肠杆菌F18感染的能力....
摘要:研究表明,FUT1基因M229和M307位点皆为断奶仔猪抗F18大肠杆菌重要变异位点.本试验采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分别对171头杜洛克猪群体M229和M307位点多态性进行分析,结果表明:M229和M307位点均检测到3种基因型,其中M307位点AA、AG、GG基因型个体数分别为47、100、24头,基因型频率分别为0.275、0.585、0.140,等位基因A为优势基因;M229位点CC、CT、TT基因型个体数分别为90、74、7头;基因型频率分别为0.526、0.433、0.041,等位基因C为优势基因;两种基因型都呈现交叉分布,其中M307位点AA基因型个体中M229位点CC/CT基因型分布较多,TT基因型分布比例较低.通过Haploview软件分析M229和M307位点之间的连锁不平衡水平,结果发现FUT1基因M229和M307位点之间的,值为0.46,呈现较低连锁不平衡水平.因此,今后在对杜洛克猪抗F18大肠杆菌育种工作中,可以尝试对FUT1基因M307和M229位点同时选育,以期为进一步确证这两个位点的遗传效应及利用其开展抗病育种选育提供一定的试验依据....
摘要:目前有研究表明FUT2基因是仔猪大肠杆菌F18受体形成的关键候选基因,探讨FUT2基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,可为进一步研究该基因对F18大肠杆菌致病的相关性提供一定的理论依据.本试验挑选4个日龄(8、18、30日龄和35日龄)苏太仔猪各4头,通过利用Real-time PCR方法分别比较分析了FUT2基因在各个体11个组织(心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠、空肠)中的表达规律.结果表明:FUT2基因在不同日龄苏太猪11个组织中均有表达,其中在肺、肾、胃、胸腺、淋巴和十二指肠中呈现较高表达,在肝、脾、空肠中呈现中度表达,在心和肌肉中呈现低表达.FUT2基因在8日龄个体空肠组织上的表达水平显著的高于其他3个日龄(P<0.05),而不同日龄仔猪十二指肠中的FUT2基因表达水平间没有显著差异(P>0.05).由此推测,8日龄左右FUT2基因的高表达可能有利于仔猪空肠组织中F18大肠杆菌受体的快速形成,需进一步对仔猪8日龄至18日龄间FUT2基因的表达变化做进一步细致的检测....
摘要:试验旨在探讨LTβR基因在仔猪出生至断奶期间的mRNA表达变化,为进一步研究该基因与F18大肠杆菌致病的相关性提供理论依据.本试验选取从初生到断奶的4个日龄(8、18、30和35日龄)苏太仔猪各4头,利用实时荧光定量PCR方法分别比较分析了LTβR基因在各个体11个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结、十二指肠及空肠)间的表达规律.结果表明,LTβR基因在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、淋巴结、十二指肠及空肠组织中呈现较高水平的表达,并且表现出明显的发育性表达差异.LTβR基因在8日龄仔猪淋巴、十二指肠和空肠组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在8日龄仔猪肺脏组织中的表达极显著高于35日龄(P<0.01),且显著高于30日龄(P<0.05);在35日龄仔猪肝脏组织中的表达极显著高于其他日龄(P<0.01);在35日龄仔猪胃组织中的表达显著高于18日龄(P<0.05).由此推测,8日龄左右为仔猪肠道免疫屏障快速形成期,LTβR基因的较高表达可能有利于仔猪对F18大肠杆菌抗性....
摘要:白细胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen 14,CD14)在先天性免疫和适应性免疫反应中都发挥重要调控作用,本研究旨在构建猪(Sus scrofa)CD14基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)干扰载体,包装成慢病毒,转染猪小肠上皮细胞,在细胞水平上进行相关功能探讨.本研究参照CD14基因(GenBank登录号:EF626695.1)全长编码区序列,设计4个靶向猪CD14基因的shRNA干扰序列,将其克隆至慢病毒表达载体质粒中,分别命名为pGLV3-CD14-1、pGLV3-CD14-2、pGLV3-CD14-3和pGLV3-CD14-4,以及阴性对照pGLV3-CD14-NC.包装成功后转染猪小肠上皮细胞系IPEC-J2,利用qRT-PCR检测其干扰效率.选择干扰效率最高的慢病毒进行药筛,获得CD14基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞系.大肠杆菌(Escherichia coli)黏附实验检测大肠杆菌F18ab和F18ac对CD14基因沉默小肠上皮细胞黏附能力的变化.结果表明,本研究成功构建4个shRNA表达载体,包装成的慢病毒均能降低猪CD14mRNA表达水平,其中pGLV3-CD14-3慢病毒的干扰效果最好,其干扰效率达到94.6%;CD14基因沉默后F18ab对小肠上皮细胞的黏附能力显著增强,而F18ac虽然也有上调,但并未产生显著性差异.研究结果表明,CD14基因沉默后的小肠上皮细胞对大肠杆菌F18ab的黏附能力显著增强,CD14基因可能在小肠上皮细胞抵御大肠杆菌F18ab感染过程中发挥了重要的调控作用.慢病毒介导的CD14沉默的猪小肠上皮细胞系的建立,不仅为在细胞水平研究CD14基因功能提供了有效模型,也为进一步探究其所在的Toll样受体/白介素-1受体(toll-like receptors/interleukin-1 receptor,TLRs/IL-1 R)信号通路在猪肠道病原微生物引起的免疫反应和抵御病原入侵的调控机制奠定了基础....
摘要:F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P<0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据....
[硕士论文] 甘丽娜
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:肠道不仅是猪体内重要的消化吸收器官,同时也是机体抵抗病原菌侵袭的第一道防线。肠道屏障能够防止肠内的细菌和病毒产生的有害物质穿过肠粘膜进入机体血液循环中,肠道屏障的受损与众多疾病具有密切的相关性。猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)导致的一种高度接触性肠道传染病,尤其在仔猪中具有很高的发病率和死亡率,研究发现肠道屏障的受损是导致在仔猪中发病率较高的腹泻和肠道炎症等疾病的重要内因之一。PEDV毒株的基因变异导致变异株毒力增强以及现有疫苗难以有效免疫,从遗传本质上增强仔猪对PEDV的抗性,从长远来看可能是抵抗PEDV侵害的有效方法。因此,从分子遗传学角度出发筛选与仔猪肠道屏障相关的关键候选基因,对于猪抗PEDV育种工作具有重要的科学价值和应用前景。
  本研究以43头“杜×长×大”8日龄三元杂交猪为研究对象,其中腹泻仔猪个体28头,正常仔猪个体15头。首先进行PEDV经典毒株RT-PCR检测,然后利用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测初步鉴定腹泻和正常仔猪个体的肠道通透性,同时屠宰仔猪采集各肠道组织并利用扫描和透射电镜直观观察结合石蜡切片的系列检测进一步验证仔猪肠道屏障完整性,以获得确证的肠道屏障完整和受损仔猪个体表型。对肠道屏障完整和受损仔猪个体肠道粘膜使用RNA-seq测序技术筛选重要调控通路及差异表达基因,并对重要候选基因进行个体和细胞水平的初步功能验证,主要试验结果如下:
  1、基于M基因的序列使用邻接法建立进化树发现腹泻病猪肠道内的毒株与目前国内外的PEDV流行株具有较高的同源性,由此确认本研究中的腹泻病猪均为PEDV病毒感染。然后采用血清D-乳酸和DAO含量检测从腹泻和正常个体中共剔除仔猪15头,初步将仔猪鉴定为肠道屏障完整组和受损组。扫描和透射电镜以及石蜡切片染色的结果显示,典型的肠道屏障完整仔猪肠黏膜结构完整,层次分明,绒毛长度和宽度均显著高于受损个体(P<0.05),黏膜上皮细胞的轮廓清晰,排列规则,杯状细胞数量较多。典型的肠道屏障受损仔猪肠道发生明显病变,肠道绒毛脱落,破损,固有层暴露,肠腺萎缩,杯状细胞数量较少。最终成功获得确证的肠道屏障受损仔猪10头,肠道屏障完整仔猪12头。本研究使用血清D-乳酸和DAO的ELISA含量检测、肠道组织扫描和透射电镜直观观察、石蜡切片检测等一系列实验建立了仔猪肠道粘膜屏障完整性的评价体系,最终成功获得了确证的肠道屏障受损和完整仔猪个体,为下一步仔猪抗腹泻病等肠道疾病的研究工作提供了宝贵的素材,同时为今后猪肠道屏障研究素材的获得提供了一个有效可行的方法和途径。
  2、使用RNA-seq技术对肠道屏障完整和受损仔猪空肠粘膜组织进行转录组测序,分别获得110.62、101.07、129.27、100.18和113.57、108.03、99.84、111.55百万个raw reads,采用HISAT2对过滤后的reads进行参考基因组的比对分析后发现Total mapped在90.75%~95.41%之间,超过70%的预期结果。3.11%~6.78%的reads在参考基因组序列上具有多处比对位置,85.43%~91.76%的reads比对位置唯一。根据p-adjust<0.05的原则,在肠道屏障完整组和受损组之间共筛选出差异表达基因(differentially expression genes,DEGs)3721个,其中受损组上调基因具有2151个,下调基因1570个。根据GO富集分析的结果筛选得到57条显著富集的GO分类(22条BP,11条CC,24条MF),CC主要包括细胞内部分(intracellular part)、细胞内细胞器(intracellular organelle)和细胞器(organelle)等,MF主要包括核苷酸结合域(nucleotide binding)、核苷磷酸结合(nucleoside phosphate binding)和小分子结合(small molecule binding)等。KEGG分析显示DEGs主要被富集到甘油酯代谢(Glycerolipid metabolism)、磷脂酰肌醇信号系统(Phosphatidylinositol signaling system)和肌醇磷酸盐代谢(Inositol phosphate metabolism)等通路中。
  3.基于基因的高表达差异倍数和生物学功能筛选了SELE、LRRK1、1TPR2、EDA、KIAA1429、PRAP1、ALPI、SDR16C5、CLDN10、ASAH、AGPAT3和KCNJ12等12个重要的候选基因,并利用实时荧光定量PCR验证转录组测序的分析结果,发现实时荧光定量的结果与转录组测序结果一致,表明转录组测序的结果准确度较高。进一步在细胞水平上通过PEDV感染IPEC-J2细胞检测这12个候选基因的表达变化,结果发现在感染PEDV病毒后这些候选基因没有发生显著的差异表达,进一步证实这些候选基因可能并不直接参与仔猪抗PEDV感染的免疫应答,而是通过维持或提高仔猪肠道屏障的完整性来抵抗PEDV感染。
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