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扬州大学
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[博士论文] 王莎莎
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:鸭脂肪细胞的形成与脂肪沉积属于复杂性状,一方面脂肪组织在维持机体稳态具有重要作用,另一方面脂肪异位过度沉积与饲料转化率、机体疾病密切相关。另外,肌肉与皮下、腹部组织中对脂肪含量的需求也截然不同,这些都是行业亟待解决的关键问题。本研究以脂肪沉积存在显著差异的樱桃谷鸭、凤头鸭及其F2资源群体为对象,从群体表型、全基因组、转录组水平等筛选出影响鸭脂肪细胞形成与脂肪沉积的候选功能基因,并整合全基因组关联分析(GWAS)与RNA组学数据,利用联合荟萃分析的方法,进一步鉴定出与脂肪生成与沉积相关的关键功能基因,旨在筛选出一批影响鸭脂肪生成与沉积的候选功能基因,为全面揭示不同鸭品种、不同部位脂肪生成与沉积的分子调控机制以及降低脂肪异位沉积造成的危害提供参考依据。
  主要研究结果如下:
  1.鸭原代前脂肪细胞诱导体系建立与成脂能力研究
  以20胚龄(E20)樱桃谷鸭脂肪组织为材料,胶原酶消化分离培养鸭原代前脂肪细胞。由于家禽的脂肪细胞自身不能合成脂肪酸,因此需要添加外源脂肪酸刺激成脂,本研究选用油酸作为鸭原代前脂肪细胞诱导剂,在10μg/μL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮组成的基础配方中添加不同浓度油酸(100μM,300μM,600μM),来探究油酸在鸭前脂肪细胞成脂过程中的作用。通过表型的定性观察和定量测定,发现在诱导2天后,视野中发现形似亮斑的小脂滴,油红O染色为红色的亮斑,诱导4-6天后,小脂滴逐渐累积,体积从小到大,梭形的前脂肪细胞开始回缩,诱导8天后,前脂肪细胞分化为圆形的脂肪细胞,细胞质被大量的脂滴填充,细胞核位于一侧,视野中的前脂肪细胞发育成椭圆形或圆形成熟脂肪细胞,所有细胞几乎都染成红色,而作为脂滴主要成分的甘油三酯含量随着诱导时间的增加逐渐升高。同时,发现在油酸添加量为300μM时,前脂肪细胞的成脂量最高,且在一定范围内,随着油酸浓度的增加,成脂量逐渐增加,增加到600μM时,油酸对成脂存在一定程度的抑制作用。根据诱导效率和表型检测,最终建立了最佳诱导体系:10μg/uL胰岛素,1μm/L DEX,0.5mmol/L IBMX,1μM罗格列酮以及300μM油酸,成功将鸭前脂肪细胞诱导为脂肪细胞。
  生产中发现大体型肉鸭品种—樱桃谷鸭与小体型鸭品种—凤头鸭相比,无论是在肌内脂肪、腹脂含量或者皮下脂肪含量上均存在显著差异,推断其前脂肪细胞的成脂能力可能存在差异。通过分离樱桃谷鸭与凤头鸭胚胎20天(E20)脂肪组织的前脂肪细胞,经过3天体外诱导后,通过CCK-8检测发现樱桃谷鸭在前脂肪细胞的增殖能力以及脂肪细胞中TG含量均显著高于凤头鸭,表明了大体型的樱桃谷鸭具有较强的脂肪生成能力。
  2.全转录组测序筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因
  为筛选鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,以20胚龄(E20)樱桃谷鸭原代脂肪前体细胞为素材,在上述前脂肪细胞的体外分离与诱导模型的基础上,对前脂肪细胞与诱导72h后的脂肪细胞进行全转录组测序,分析mRNA,miRNA,lncRNA与circRNA的差异。结果表明,与前脂肪细胞相比,诱导72h后的脂肪细胞中共筛选到4702个差异表达的mRNA(2606个基因显著上调,2096个基因显著下调),839个差异表达的lncRNA(58个lncRNA显著上调,781个lncRNA显著下调),141个差异表达的circRNA(66个circRNA显著上调,75个circRNA显著下调),59个差异表达的miRNA(32个miRNA显著上调,27个miRNA显著下调)。通过GO与KEGG功能注释发现,差异基因大量地富集在与脂肪有关的不饱和脂肪酸、脂肪酸的生物合成以及细胞代谢等过程中,通路分析的结果显示,差异表达基因显著富集在脂肪酸代谢通路,类固醇的生物合成,PPARγ信号通路等。采用RT-qPCR对9个mRNA,7个lncRNA,7个circRNA,15个miRNA在樱桃谷鸭样本上进行验证,发现表达趋势、差异显著性与转录组测序结果均一致,证实了转录组测序结果的可靠性。通过生物信息学预测了差异表达lncRNA与circRNA的靶向miRNA,构建了lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的竞争内源调控机制,其中,起关键的作用包括XLOC_014103-miR-181b-5p-MMP13,XLOC_001895-miR-122-5P-KLF2,circ_0003172-miR-15c-5p-LYZ,circ_0009143-miR-206-FAS和circ_0003172-miR-219b-KLF2等,为进一步研究鸭脂肪细胞中的成脂机制奠定了基础,筛选出与成脂过程中的关键RNA。
  在上述初步筛选的基础上,我们将鸭脂肪细胞成脂关键功能基因,包括DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL进行细胞水平的功能验证,发现随着前脂肪细胞的分化与脂肪形成的过程中,DLK1作为前脂肪细胞因子在前脂肪细胞中表达量最高,伴随着诱导过程其表达量逐渐下降,到诱导10天后,DLK1的表达量最低,几乎不表达。FABP4和LPL基因的表达量最高峰出现在诱导10天后,而在诱导8天后,C/EBPα和FAS的表达量达到最高点。随着诱导分化时间的延长,PPARγ的表达逐渐增加,最高峰在诱导后的第6天。以上表明DLK1,PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等基因在脂肪形成中均发挥重要作用。
  为了进一步研究PPARγ这一影响家禽脂肪性状的明星基因,同时以上测序数据与细胞水平验证结果,也发现PPARγ在鸭脂肪形成中发挥着关键作用。因此,我们筛选出对PPARγ特异性干扰作用的siRNA进行了敲低实验。干扰PPARγ48h后,发现原代脂肪细胞TG含量下降,同时相关成脂基因的mRNA表达水平也表现为下降,其中,转录因子C/EBPα与FABP4基因的表达水平均下降但差异不显著,而LPL的表达水平显著下降(P<0.05)。表明PPARγ确实能够影响鸭脂肪形成,并发挥关键作用,是重要的候选基因之一。
  在上述试验中已经发现樱桃谷鸭与凤头鸭的成脂能力存在差异,为探明不同品种的成脂差异的分子机制,我们对樱桃谷鸭与凤头鸭的的差异miRNA和关键mRNA进行了比较分析。首先从诱导72h后的凤头鸭脂肪细胞与前脂肪细胞比较中筛选出影响凤头鸭成脂的关键miRNA,结果发现差异显著的miRNA有105个(50个miRNA显著上调,55个miRNA显著下调)。选择其中7个miRNA在凤头鸭原代细胞中进行表达水平验证,结果与测序结果一致。在樱桃谷鸭与风头鸭中,共有37个miRNA是樱桃谷鸭与风头鸭所共有的,且在这37个交集miRNA中,有31个在2个品种中的表达趋势是一致的,推测这些miRNA可能在脂肪的生成过程中发挥不可缺少的作用;同时发现有22个miRNA在樱桃谷鸭成脂过程特异表达,68个miRNA在凤头鸭的成脂过程特异性的发挥作用,通过靶基因预测后,我们发现了419个特异性在樱桃谷鸭成脂过程表达的基因,显著富集到了包括脂肪酸的延伸,生成和代谢等过程。进一步对其中的成脂关键基因:PPARγ,FAS,C/EBPα,FABP4和LPL等在2个品种上进行验证,发现除LPL外,诱导72h后樱桃谷鸭的脂肪细胞的4个基因表达量均显著高于凤头鸭,再次在分子水平上验证了大体型的樱桃谷鸭脂肪形成沉积能力高于凤头鸭。
  3.全基因组关联分析鉴定肌内脂肪与腹脂沉积候选基因
  为了进一步鉴定出鸭脂肪形成的关键基因,在细胞水平研究的基础上,我们从个体水平通过全基因组关联分析影响鸭脂肪形成沉积的关键基因或标记,以期进行生产应用。构建了樱桃谷鸭(♂)×风头鸭(♀)杂交F2资源群体共304只并进行样品采集,采血并测定腹脂重与胸肌肌内脂肪含量,提取DNA通过10×全基因组重测序,结合表型值进行全基因组关联分析。结果显示,肌内脂肪范围为1.260%~1.503%,均值为1.387%,腹脂重范围为4g~51g,均值为27.622g,性状表型值符合正态分布,通过Bonferroni多重检验校正法确定P value的显著性阈值为5(-log10P)时,对胸肌肌内脂肪含量性状共定位到14个极显著的SNPs,根据NCBI,Ensembl,KEGG,Uniprot,GeneCards等数据库信息,利用生物信息学和比较基因组的方法,对显著位点的SNP周围1个LD(20kb)距离的基因进行功能注释,发现了包括BARHL2,SLC22A16,THBD,OGDH,CD93,Ctgf等共25个基因,这些基因功能主要涉及DNA结合转录因子活性,转运蛋白家族,神经元迁移,磷酸肌醇酯酶等,具有激酶活性,参与信号转导等多个方面。腹脂重性状定位到12个极显著SNPs,注释后共包含MI CALL1,GALR3,SOX10,EIF3L,POLR2F等48个基因,将所有筛选的脂肪相关基因进行功能注释后,发现包括PGDFB和ATF4等显著富集到了MAPK以及激素代谢等信号通路。MAPK信号通路同时在肌内脂肪与腹脂重性状中发挥调控作用,同时,由LAMA4参与的PI3K-AKT通路通过糖酵解和糖质新生等过程调控肌内脂肪的生成与代谢,而由PDGFB与ATF4通过SOS信号通路与Erk1/2作用,对PPARγ通路的抑制作用调控脂肪沉积。
  4.GWAS与转录组联合分析鉴定鸭脂肪形成沉积基因
  整合转录组测序与全基因关联分析的结果发现,全基因组关联分析的26个SNPs中的73个基因,与转录组筛选的4702个差异基因进行联合分析后发现,共存在18个交集基因(LAMA4,SYNJ1,CD164,CDK19,SLC22A16,RPF2,GTF3C6,AMD1,SSTR4,CARD11,SH3BP1,GCAT,MICALL1,POLR2F,JOSD1,RPL3,PDGFB,MGAT3),通过功能注释与通路分析,筛选到影响鸭脂肪形成与沉积的关键基因PDGFB,MGAT3,LAMA4,SLC22A16,AMD1,CD164等,将筛选出的基因进行通路分析后,发现PDGFB与mTOR信号通路密切相关,因此提出以下假说,PDGFB可能通过启动PI3K/Akt信号通路对mTOR信号通路产生抑制作用,进一步与PPARγ信号通路的发生作用,与mRNA,miRNA,lncRNA和circRNA等共同调控脂肪的生成。
  综上所述,鸭脂肪形成沉积的过程是复杂的,PDGFB,MGAT3,LAMA4,SLC22A16,AMD1,CD164在全基因组SNP水平和转录水平对鸭脂肪形成沉积具有较大效应,同时表明ARHL2,ATF4在全基因组SNP水平,MMP13,KLF2等基因在转录水平可能是影响脂肪的形成与沉积关键候选基因。
摘要:抗原处理相关转运体基因(TAP)位于主要组织相容性复合体区域,而由TAP1和TAP2组成的二聚体能够将抗原肽从细胞质转运入内质网腔,因此,其在免疫反应过程中发挥重要的呈递作用.[目的]检测26个鸡种TAP2基因全长的序列信息,分析TAP2基因单核苷酸多态性,并进一步研究TAP2不同SNPs位点对其蛋白结构的影响及其在不同鸡种中的遗传变异特点.[方法]采用目标捕获序列测序方法,检测26个鸡种的260个体的TAP2基因全长,利用DNAMAN软件对26个鸡品种的测序序列进行比对分析,筛选不同鸡种TAP2基因存在的SNP位置以及类型,并通过软件预测分析SNP对蛋白的影响,进一步构建系统进化树,探究不同鸡种同源性.[结果]TAP2基因总共有效测序长度为3037 bp,在不同鸡种中一共发生了20个位点的突变,具有较为丰富的遗传多样性,其中9个SNP发生在外显子上,其余则存在于内含子,同时分析了对编码氨基酸产生影响的4个SNP(rs316795220、rs738706078、rs739725385、rs732937653)对蛋白结构的影响.[结论]鸡TAP2基因具有较高的多态性,这些丰富多态的基因的存在为进一步利用丰富的资源提供了原始材料.该研究为TAP2基因转运抗体功能关联研究候选SNPs的选择提供了科学依据....
摘要:以27个鸡品种为试验材料,通过目标捕获测序技术检测NFKB1基因SNPs位点多态性,分析鸡NFKB1基因的遗传效应;通过最大简约法进行系统进化树构建,探讨NFKB1基因的多态性与不同鸡品种的关系.结果表明:27个鸡品种的NFKB1基因上共存在233个突变位点,其中外显子存在6个突变位点,显示出丰富的基因多态性;外显子14上的SNPs位点特异性存在于隐性白羽鸡和AA鸡,并引起了相应的氨基酸变化,该位点可作为这一基因的特异性候选位点.同时,NFKB1基因在外来鸡品种与地方鸡品种、蛋用型与肉用型鸡品种间存在差异,为进一步研究不同鸡品种间的差异提供参考资料....
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