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摘要:实验动物的遗传质量直接影响生物医药研究结果的可信性,遗传质量控制手段的多样性直接决定实验动物的遗传质量水平.本标准制定的目的是为实验小鼠和实验大鼠的遗传质量控制提供DNA检测方法,弥补现行方法的局限性,填补我国在该领域的空白,推动我国实验动物遗传质量检测水平的提高....
摘要:目的 通过小鼠感染MNV后外周血免疫指标的改变来评估MNV感染对小鼠免疫功能的影响.方法 选取KM,BALB/c,BALB/c-nu,C57BL/6及NIH等五个品系小鼠,每个品系分成MNV感染组和对照组,于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天从眼周静脉采集抗凝血,流式细胞术测定总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、总B细胞、NK细胞及NK-T细胞占总淋巴细胞的百分比及干扰素、白介素、趋化因子等13种细胞因子的含量,比较感染后各指标总体均值的差异,分析各时间点变化情况.结果 与对照组相比,KM小鼠感染组总T细胞、CD4+T细胞含量显著增高(P<0.01),CD4/CD8显著增高(P<0.05),总B细胞及CXCL10含量显著降低(P<0.01);BALB/c小鼠CD8+T细胞显著降低(P<0.05),IFN-γ 含量显著增高(P<0.01);BALB/c-nu小鼠各免疫细胞均无统计学差异,TNF-α、CXCL1及CXCL10显著增高(P<0.01),CCL2显著增高(P<0.05),IFN-β 显著降低(P<0.05);C57BL/6小鼠CD4+(P<0.05)CD8+T细胞(P<0.01)均显著降低,总B细胞及IL-10显著增高(P<0.05),CCL5及GM-CSF显著降低(P<0.05);NIH小鼠总T细胞和CD8+T细胞显著增高(P<0.01),CD4/CD8显著降低(P<0.05),总B细胞显著降低(P<0.01),细胞因子均无统计学差异.对于有统计学差异的免疫指标,有半数感染第7天即出现显著差异,大多数第28天仍存在显著差异.结论 MNV的感染会影响正常小鼠的细胞免疫和体液免疫应答,而且不同品系的动物影响不同,建议在进行免疫相关的动物实验时选择MNV阴性小鼠,以避免实验结果出现偏差....
摘要:随着生命科学的发展,对实验动物质量的要求也越来越高,实验动物标准的不断完善就变得尤为重要,小鼠诺如病毒在实验小鼠中有很高的感染率,小鼠感染后不仅对动物本身造成危害,对实验结果也会产生较大影响.我国的实验动物国家标准目前还未将小鼠诺如病毒纳入常规检查项目,我们参考国内外小鼠诺如病毒的最新研究成果及国外相关标准,编制了小鼠诺如病毒的团体标准.本文介绍了小鼠诺如病毒检测方法团体标准编制的背景、法律法规依据,对标准内容的设置进行了解释.本标准的编制完善了实验动物相关标准,为推动实验动物质量的提高,适应实验动物国际化发展的需求提供了技术支持....
摘要:目的 通过对2014-2016年北京地区实验动物微生物、遗传质量抽检结果 的回顾总结,为实验动物的生产、管理和检测提供参考.方法 按照国家和地方现行实验动物检测标准,由北京市实验动物管理办公室组织对北京地区具备资质的实验动物生产单位进行抽样,委托检测机构质检并发布报告.依据检测数据,对3年中不同级别大小鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴、小型猪8个品种的实验动物的质量进行评价分析.结果 3年分别抽检动物120、133、1 30批次,检出不合格批次为16、17、23批.不合格主要因素为兔、犬、猪免疫不达标(49批),小鼠遗传变异3批,嗜肺巴斯德杆菌阳性1批,豚鼠沙门菌和呼肠孤病毒Ⅲ型抗体阳性各1批,犬沙门菌阳性1批.结论 实验动物质量监测是其质量管理的重要手段,为动物生产管理提供了科学依据....
摘要:目的 建立同时检测小鼠微小病毒(MVM)和小鼠细小病毒(MPV)的荧光定量PCR方法,并进行初步应用.方法 比对NCBI上发表的MVM和MPV基因组序列,设计1对引物和探针,可同时检测MVM和MPV.考察MVM-MPV引物探针的特异性和灵敏度,并对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测.结果 MVM-MPV荧光定量PCR方法最佳线性范围为109~104拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强.应用MVM-MPV探针对178份小鼠粪便DNA检测,结果为2份阳性样本,经MVM、MPV特异性探针鉴定,2份阳性样本均为MPV感染.阳性样本经全基因组测序后与NCBI网站上MPV(NC_001630.1)序列比对,一致率为96%.结论 建立的MVM-MPV荧光定量PCR方法,能够有效快速地同时检出小鼠细小病毒和小鼠微小病毒....
摘要:目的 建立树鼩副粘病毒(Tupaia paramyxovirus,TPMV)PCR检测方法,并进行初步应用.方法 根据NCBI公布的TPMV基因组序列,选择8231 bp~8720 bp区域人工合成一段DNA序列并转入质粒中,作为阳性标准质粒.根据TPMV保守区域设计一对特异性引物,考察方法的特异性和灵敏度,并应用于60份树鼩呼吸道咽拭子cDNA及12份树鼩肺组织cDNA的检测中.结果 所建立的PCR检测方法特异性好,灵敏度高,可达11.5 × 10 -5μg/mL.60份树鼩呼吸道咽拭子cDNA及12份树鼩肺组织cDNA检测均为阴性.结论 建立的树鼩副粘病毒PCR检测方法特异性强,灵敏度高,可用于树鼩副粘病毒的常规检测中....
摘要:目的 建立用于牛源性样本中牛副流感病毒3型(BPIV3)RT-PCR检测方法.方法 选择已发表的BPIV3神经氨酸酶(HN)基因高度保守区域作为靶基因,设计合成引物,建立BPW3 RT-PCR方法.并对方法的特异性、敏感性、重复性、稳定性等进行方法学评价.同时用建立的RT-PCR方法检测137份牛源性样本.结果 建立的BPIV3 RT-PCR方法与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛鼻气管炎病毒(BHV-1)、仙台病毒(SV)均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为6 lgTCID50/mL;BPW3cDNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带;应用建立的方法检测137份牛源样本,核酸阳性率为14.6%.结论 建立的BPIV3荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源性样本中BPIV3核酸的检测....
摘要:目的 建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查.方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC 001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证.人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,最后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本.结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的最低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量最高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性.结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考....
摘要:目的 建立用于牛源样本中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法.方法 选择已发表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5' UTR区高保守区域基因作为靶基因,分别设计合成引物,建立双重BVDV RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价.同时用建立的RT-PCR方法检测了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性样本和64份牛血浆样本.牛源样本和64份牛临床样本.结果 建立的BVDV RT-PCR检测方法与牛副流感病毒III型(BPIV3)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)均无交叉反应;检测BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低浓度分别为每微升8.87 × 102拷贝和6.31 × 102拷贝, BVDV 1型和2型cDNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带.应用建立的BVDV RT-PCR方法检测41批次牛源样本和64份牛血浆样本,核酸阳性率分别为14.6%和29.7%.结论 建立的BVDV RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源样本携带BVDV核酸的检测....
摘要:目的 建立牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)PCR检测方法,用于临床牛样本中BHV-1的检测.方法 根据已发表的BHV-1 gB基因保守区域设计合成引物,建立BHV-1 PCR方法,对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价,并用建立的PCR方法检测64份牛临床样本.结果 建立的BHV-1 PCR检测方法与牛副流感病毒Ⅲ型(BPIV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)、犬疱疹病毒(CHV)、均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为5lg TCID50/mL,对应的DNA模板浓度为5.26×102拷贝/μL;BHV-1 DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带.应用建立的方法检测145份牛源组织样本,BHV-1核酸阳性率为15.2%.结论 建立的BHV-1PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,适合于临床牛样本BHV-1的感染的检测....
摘要:目的 对北京地区两个封闭群巴马小型猪群体进行遗传质量评价与分析.方法 利用DB11/T828.3-2011中的25对微卫星引物,对A、B两个巴马小型猪群体进行微卫星分型及遗传参数计算.结果 A、B两巴马小型猪群体分别得到126和160个等位基因,平均杂合度分别为0.6541、0.6973,平均多态信息含量(PIC)分别为0.6037、0.6605,两者的遗传距离为0.2650.结论 B群巴马小型猪群体具有较好的遗传多样性和稳定性,符合封闭群动物的群体遗传特征....
摘要:目的 了解小型猪感染乙型脑炎病毒株的特点.方法 猪脑组织经过处理,接种BHK21细胞,进行病毒培养、间接免疫荧光试验、中和试验、电镜观察,及通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离毒株E区段和PrM区段核苷酸序列,测序后进行基因型鉴定.结果 25只猪脑组织接种BHK21细胞,有3个组织处理液能使BHK21细胞发生圆缩、集聚等病变;3个组织接种的BHK21病变细胞滴片进行免疫荧光试验,均产生强绿色荧光反应;中和实验结果显示3株新分离株中和效价均为1∶64;电镜下可见直径40nm左右球型病毒粒子;RT-PCR产物测序结果与疫苗株E区段核苷酸比较同源性均为95%;3株新分离株均为GIII型乙脑病毒.结论 实验表明小型猪场存在乙型脑炎病毒感染,为GIII型乙型脑炎病毒....
摘要:目的 了解全国实验动物检测相关实验室在大鼠仙台病毒抗体检测项目上的技术水平,发现并解决检验中存在的问题,促进各实验室加强质量管理,提高检测水平.方法 制备标准实验大鼠血清样品,经过标定后分装,按照CNAS的要求进行均一性和稳定性验证,标定好的样品随机编号并随机发放给各参加实验室,每个实验室3个样本,在规定时间内反馈结果,结果以阳性或阴性表示,与预期结果均一致者判为满意结果,不完全一致或逾期未反馈结果者判为不满意.结果 来自18个省市自治区的28家单位报名参加本次比对实验,均在规定时间反馈了结果,其中25家单位获得满意结果,占参加比对实验室的89.3%;结果不满意的3家单位,其中1家有1个样品与预期结果不符,另外2家均有2个样品与结果不符.28家单位中有27家采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测,另外1家用免疫荧光法(IFA)检测.反馈的原始记录总体真实可信,个别参加单位存在检测试剂来源不清、操作过程不详及阳性结果未进行复检等问题.结论 各实验动物检测机构大鼠仙台病毒总体检测能力较高,本次能力验证计划的实施能够反映实验室的检测水平....
摘要:目的:对北京地区中国农大小型猪三个亚系群体进行遗传质量评价与分析。方法利用DB11/T828.3-2011中的25对微卫星引物,对3个中国农大小型猪亚系群体进行微卫星分型,利用群体遗传分析软件Popgen32对所得结果进行处理分析。结果农大I系、农大II系和农大III系小型猪群体分别得到130、122和138个等位基因,平均杂合度分别为0.6759、0.5967、0.6779,平均多态信息含量( PIC)分别为0.6344、0.5540、0.6403;农大II系和农大III系的遗传距离为0.4251,农大I系与农大II系的遗传距离为0.2084。结论三个亚系中,农大II系和农大III系小型猪均具有较好的遗传多样性和稳定性,符合封闭群动物的群体遗传特征。...
摘要:目的 建立流感疫苗主种子批毒种中外源性禽腺病毒Ⅲ型(egg drop syndrome virus,EDSV)的荧光定量PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 针对EDSV六邻体蛋白保守区分别设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的线性、特异性、精密性、灵敏度及可行性.采用新建立的荧光定量PCR法对16株流感疫苗主种子批毒种进行外源性EDSV检测.结果 该方法的最佳线性范围为1×104~1 × 109 copies/μl,回归曲线为y=-3.385x+39.616,R2>0.99;与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应;试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均<2%;灵敏度为101 copies/μl;该方法检测P0代样品的最低检测限为10-6掺入体积比例,血清学方法检测P0 ~ P3代样品的最低检测限为10-2~ 10-3掺入体积比例.该方法检测16株流感毒种中外源性EDSV的结果均为阴性,与血清学方法检测结果一致.结论 成功建立了检测EDSV的荧光定量PCR法,提高了检测灵敏度和检测效率,更好地满足了流感疫苗应急检验中快检的要求....
摘要:目的:对鼠管状线虫进行分子鉴定和感染调查,为国家标准的修订提供参考依据。方法923批5199只SPF动物(包括:1批5只猴,3批25只小型猪,28批55只兔,13批248只地鼠,37批198只豚鼠,93批459只大鼠,742批4179只小鼠,5批25只鸡和1批5只鸭)和145批1389只清洁动物(包括:1批3只兔,4批31只地鼠,16批157只豚鼠,32批268只大鼠和92批930只小鼠)来自全国50个不同的厂家。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术结合形态学鉴定方法,进行鼠管状线虫感染筛查。应用多重PCR和测序技术,鉴定分离的鼠管状线虫ITS(内转录间隔区)、28S rRNA(28S核糖体RNA)、nad1(NADH脱氢酶亚单位1)和cox1(细胞色素C过氧化物酶亚基1)基因,从分子水平上确证鼠管状线虫感染。结果应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从动物中检出鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫。根据鼠管状线虫的卵细胞、幼虫、雌雄成虫的大小和形态来鉴定虫种。应用多重PCR测序技术,能从分离的单个鼠管状线虫的虫卵、幼虫和成虫中鉴定出ITS、28S rRNA、nad1和cox1基因,与其他不同种属的寄生虫无交叉反应。应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术,从5199份SPF和1389份清洁动物样本中分别检出鼠管状线虫阳性样本285份和135份。应用多重PCR和测序技术,鉴定证明这些阳性样本中确实含有鼠管状线虫特异性的DNA。测序结果显示,不同动物分离的鼠管状线虫的ITS、28S rRNA、nad1和cox1部分基因序列核苷酸相似性达100%。 SPF和清洁动物的鼠管状线虫感染率分别为5?5%(285/5199)和9?7%(135/1389)。结论应用直接镜检实时动态显微视屏摄录技术联合多重PCR测序技术能够快速精准检测鉴定出鼠管状线虫。鼠管状线虫的人兽共患本质可以视作为公共卫生的一个预警。良好的动物质量控制对保护人类身体健康和保障人民用药安全具有重要作用。本研究对中国SPF和清洁动物的鼠管状线虫进行了分子鉴定和感染调查。...
摘要:目的:通过兔出血症病毒抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过筛选血清制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果来自14个省市自治区的20个实验室报名参加本次比对实验,均在规定时间内反馈了检测结果,17个实验室检测结果为合格或优秀,占参加比对实验室的85%。在20个实验室中,14个实验室采用了酶联免疫吸附实验( ELISA)方法,6个实验室采用血凝抑制实验( HAI)方法。结论全国各实验动物检测机构兔出血症病毒抗体总体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。...
摘要:目的:通过实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有17个省市的27个实验动物检测机构报名参加本次能力验证项目。27个检测机构均提交了满意结果,占总参加机构的100%。采用酶联免疫吸附实验( ELISA)方法的有26个检测机构,采用免疫荧光实验( IFA)方法的有1个检测机构。结论实验动物质量检测机构实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。...
摘要:目的通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,通过低温冻干制备样品,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有28个实验室参加本次能力验证项目,其中获得满意验证结果的实验室为22个,占总参加机构的78.57%;未得到满意验证结果的实验室为6个,占21.43%。采用国标检测方法的有27个,采用PCR检测方法的有1个。结论实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。...
摘要:目的 建立H-1细小病毒抗体的ELISA检测方法,并进行初步应用.方法 采用大鼠神经胶质瘤细胞C6培养大鼠H-1细小病毒,制备包被抗原,采用纯化后抗原建立该病毒的ELISA检测方法;将建立的方法与国外同类试剂盒进行比对,考察该方法的特异性和灵敏度.同时,应用该方法对35份大鼠血清进行检测.结果 所建立的方法可检测出稀释1280倍的阳性血清;与犬细小病毒、小鼠微小病毒和猪细小病毒阳性血清均无交叉反应;与大鼠细小KRV病毒有交叉反应;对35份大鼠血清进行检测,结果均为阴性,与国外同类试剂盒结果一致.结论 所建立的H-1细小病毒ELISA检测方法具有良好的种属特异性和灵敏度,可用于大鼠血清中H-1细小病毒抗体检测....
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