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[硕士论文] 王曼曼
细胞生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic Stem Cells,mESCs)是分离自着床前囊胚期内细胞团的细胞(Inner cell mass,ICM),在体外培养具有无限自我复制式增殖的能力,简称自我更新(Self-renewal),以及多向分化的潜能,简称多能性(Pluripotency)。小鼠的ESCs注射到囊胚中具有形成嵌合体动物的能力,这种发育状态称为Na(i)ve或者Ground多能性状态。而小鼠的上胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)与人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)在注射到囊胚后不能形成完整的嵌合胚胎。hESCs和mEpiSCs的这种相似的发育状态称为Primed多能性状态。小鼠和人的ESCs需要不同的培养条件来维持其多能性状态。通过在培养体系中加入相应地小因子、生长因子或细胞因子来激活或抑制细胞内的信号通路,从而能够维持ESC的自我更新和多能性。
  无饲养层培养体系中加入血清(serum)和细胞因子LIF(Leukemia Inhibitory Factor)可以在体外长期维持mESCs的自我更新和多能性。LIF作为胞外信号,主要通过激活细胞内的JAK(Janus kinase)/STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3)信号通路,从而激活下游相关转录因子表达来维持mESCs的Naive多能性状态。一些LIF/STAT3信号通路的下游靶基因己被筛选并鉴定出来,例如Gbx2,Klf4,Sps和5和Tfcp2l1等。然而,这些基因在促进mESC自我更新方面的机制仍不清楚。
  转录因子Gbx2(Gastrulation brain homeobox2),即原肠胚形成和脑特异性同源蛋白框2,被证明是LIF/STAT3信号通路的直接下游靶基因。过表达Gbx2的小鼠胚胎干细胞能够在无LIF的血清培养基质中长期维持自我更新和多能性;并且过表达Gbx2还能够促进mEpiSCs重编程为类似于小鼠胚胎干细胞(mESCS-like)的Na(i)fve多能性状态。但是,关于过表达的Gbx2如何替代LIF维持胚胎干细胞自我更新和多能性的分子机制,目前在国内外并未有相关报道。也就是说,LIF/STAT3信号通路中,Gbx2激活哪些关键的下游基因来发挥作用呢?为探究该问题,本课题首先进行了Gbx2靶基因的筛选和鉴定。利用PiggyBac(PB)载体系统转染的方法,在46C小鼠胚胎干细胞中过表达Gbx2(PB-Gbx2),对照组转染PB空载体,然后通过RNA-Seq结合生物信息学分析的方法对Gbx2候选靶基因进行初步筛选,包括显著性基因表达聚类分析、GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析干细胞多能性信号通路相关的基因。qRT-PCR初步验证结果显示,相比于对照组PB mESCs,PB-Gbx2mESCs中Klf4,Nanog的mRNA表达水平增加了约2.0fold以上。为了进一步探宄Gbx2对Nanog和Klf4表达的调控作用,我们从以下三个方面入手。首先,正常LIF/serum培养PB和PB-Gbx2mESCs,撤掉LIF1h到24h,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示:过表达的Gbx2能够抑制LIF的撤除所导致的Klf4下调,却不能抑制Nanog下调。其次,加入4-OHT(4-hydroxytamoxifen)诱导Gbx2-ERT2mESCs中Gbx2的激活,qRT-PCR结果显示:随着4-OHT加入时间的增加(0-120minutes),Klf4的表达也明显上调,而Nanog的表达无明显趋势。最后,在mESCs中下调Gbx2的表达,qRT-PCR结果显示只有Klf4的表达显著降低。以上结果表明,Klf4是Gbx2调控的下游基因。为了进一步证明Klf4是否为Gbx2直接调控的靶基因,本课题从JASPAR核心数据库(the JASPAR CORE database)在线分析和预测Gbx2在Klf4启动予(Promoter)上的结合位点(binding motifs)。之后通过对PB-Gbx246C mESCs进行染色质免疫共沉淀(ChIP)并检测Klf4启动子序列所控制且由Gbx2所激活的荧光素酶的活性,数据证明了Klf4是Gbx2的直接靶基因。
  以上结果验证了Klf4是Gbx2的直接靶基因,那么Gbx2在功能上是否依赖靶基因Klf4的表达呢?因此,本课题后期主要针对靶基因Klf4对Gbx2促进自我更新和重编程功能两方面的影响进行探究。该部分研究结果如下:1.碱性磷酸酶染色及多能性标志基因NANOG蛋白的免疫荧光染色等数据显示,在过表达Gbx2的小鼠46C胚胎干细胞中将Klf4的表达敲低,Gbx2的过表达维持mESC自我更新和多能性的功能显著降低,即:靶基因Klf4介导了Gbx2的促自我更新效应。2.在CD1mEpiSCs中过表达Gbx2,并knockdown靶基因Klf4的表达,与对照组相比,该细胞克隆出现明显的死亡或分化。因此,Klf4的下调消除了Gbx2促进mEpiScs重编程的效应。由此我们得出结论:对于Gbx2促进mEpiSCs重编程为Na(i)ve多能性状态效率的能力,靶基因Klf4也是至关重要的。
  综上所述,本课题揭示了LIF/STAT3信号通路中转录因子Gbx2维持和诱导小鼠胚胎干细胞Na(i)ve多能性状态的分子机制:Gbx2直接调控靶基因Klf4的转录表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新以及促进小鼠上胚层干细胞重编程到类似小鼠胚胎干细胞的状态。这一发现不仅扩大了我们对多能性调控网络的认识和理解,也为进一步探究和优化小鼠甚至人胚胎干细胞的体外培养和分化条件提供了线索。
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