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摘要:TRIM(Tripartite-motif protein)家族是机体先天性免疫的重要成员,参与细胞增殖分化、细胞凋亡、肿瘤抑制、抗病毒等过程.为了进一步探究TRIM蛋白在鱼类免疫中的作用,实验利用PCR方法克隆了草鱼TRIM32基因的编码区全长,共1980 bp,编码660个氨基酸.草鱼TRIM32具有TRIM家族典型的3个结构域,与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高,遗传进化分析也聚为一支.间接免疫荧光、Western-blotting检测结果显示草鱼TRIM32在EPC细胞中成功表达,主要以点状分布在细胞质中,细胞核中表达量较少;组织分布分析表明TRIM32在被检测的11个组织中均有表达,其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织;不同胚胎发育时期的表达分析进一步表明,TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.05),随后表达量下降,直到出膜后表达量再次显著性升高.此外,双荧光素酶检测系统显示TRIM32能够激活NF-κB信号通路,诱导下游的炎症反应.结果显示,草鱼TRIM32广泛分布于鱼体内,并参与机体的天然免疫反应,对于抵抗病原体的入侵具有重要作用....
摘要:以含有鲤春病毒血症病毒核蛋白基因的质粒N-RFP为模板,通过PCR方法扩增N基因编码区全长,大小为1 254 bp.将该基因连接到pGEx-KG载体上,构建了SVCV-N-KG重组质粒.将重组质粒转化到BL21菌株中进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳分析鲤春病毒血症病毒N蛋白的表达情况.以纯化后的N蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA测定免疫小鼠的血清效价.将血清效价较高的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,4次亚克隆后,通过ELISA及染色体数目分析筛选出1株杂交瘤细胞,命名为N-2.将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔制备单克隆抗体.经间接免疫荧光和免疫印迹实验证明该抗体可以特异性识别鲤春病毒血症病毒N蛋白.进一步分析表明,该抗体识别的靶位点位于N蛋白第227~336位氨基酸之间....
[专利] 发明专利 CN201811217731.6
华中农业大学 2019-03-08
摘要:本发明属于水产动物基因工程技术领域,具体涉及一种分离的鱼类抗病毒蛋白基因CMPK2及其抗病毒活性。从黑头呆鱼(Pimephales promelas)中分离得到一种抗病毒天然免疫蛋白基因CMPK2,该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示,其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明克隆的CMPK2蛋白基因的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(SVCV)的增殖,且CMPK2蛋白在SVCV的生活周期中发挥着重要的作用。本发明的基因或蛋白为制备抗SVCV药物的研究提供了新的靶点。
[硕士论文] 王方
水生生物学 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)为单股负链RNA病毒,可引起鲤发生大规模死亡,给渔业带来巨大经济损失。SVCV基因组编码5种结构蛋白,即核蛋白N(Nueleoprotein)、磷酸化蛋白P(Phosphoprotein)、基质蛋白M(Marxprotein)、糖蛋白G(Glycoprotein)和RNA聚合酶L(Polymerase)。其中核蛋白N是组成核衣壳结构的关键蛋白,且表达量最大,在病毒的基因转录及调控中具有重要作用。哺乳动物Viperin具有抗病毒功能,鱼类Viperin在抗病毒过程中也具有重要作用,但其潜在机制尚不清晰。本实验制备了SVCV核蛋白N的单克隆抗体,为探究SVCVN蛋白的功能及病毒检测提供了有效工具;同时围绕SVCV对Viperin及其剪接异构体有何影响,Viperin及其剪接异构体如何影响SVCV感染展开深入研究,以期从天然免疫的角度揭示Viperin的选择性剪接与SVCV的关系,为解析SVCV的免疫与致病机制、防控产品的开发提供科学依据。主要内容如下:
  1.SVCV N单克隆抗体的制备
  以含有SVCV N的质粒N-RFP为模板,扩增N基因(1254bp),并将该基因连接至pGEX-KG载体,构建原核表达质粒。将重组蛋白在感受态BL21中诱导表达及纯化,并将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,将血清中抗体效价较高的小鼠免疫B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。通过ELISA方法检测,筛选出杂交瘤细胞并命名为N-2。将杂交瘤细胞注射至BALB/c小鼠腹腔内制备大量单抗。间接免疫荧光(IFA)和免疫印记(Western blot)实验结果表明,制备的抗体可特异性识别SVCVN蛋白,且该抗体识别的靶点位于SVCV N的第227~336位氨基酸之间。
  2.Viperin及其剪接异构体抗SVCV功能研究
  选择性剪接是真核基因转录后的修饰的过程,存在于大多数免疫相关基因中。本研究在感染了SVCV的胖头觞肌肉细胞系(Fathead minnow muscle cell,FHM)中发现了一种Viperin的剪接异构体,命名为Viperin_sv1。实验表明SVCV可以诱导Viperin及Viperin_sv1mRNA的产生,Poly(I∶C)对Viperin具有诱导作用但对Viperin_sv1无明显影响。通过IFA实验发现,Viperin及Viperin_sv1部分定位在线粒体,且两者在FHM细胞质中具有共定位的现象。Viperin在SVCV感染早期对病毒具有抑制作用,但随着病毒不断的复制,其抗SVCV作用显著减弱。Viperin_sv1在FHM细胞感染SVCV的不同时间均发挥抗病毒的功能。Viperin_sv1可显著诱导IFN及ISG分子(包括Mxb和PKR)的mRNA产生,而Viperin无此作用。进一步实验发现,Viperin_sv1可以显著诱导IFN上游的RIG-Ⅰ,IRF3及IRF7的产生,而对NF-κB无明显影响。这表明鱼类Viperin_sv1而非Viperin可通过IRF3/7通路激活IFN进而抑制SVCV的复制。尽管SVCV可诱导Viperin_sv1mRNA表达,但可以下调其蛋白水平。蛋白酶抑制剂MG132可以保护SVCV引起的Viperin_sv1蛋白水平降解,且可以拯救Viperin_sv1的抗病毒功能。这表明SVCV可调控Viperin_sv1通过蛋白酶体途径降解进而抵消其部分抗病毒作用。
[专利] 发明专利 CN201610223098.6
华中农业大学 2016-08-17
摘要:本发明涉及一种制备符合有机食品加工标准的鱼油微胶囊的方法,取海藻酸钠溶液,加入芝麻粕、鱼油混均后经过高压均质成为稳定的乳液;乳化液进行压力喷雾,雾化后的小液滴落入氯化钙溶液中形成鱼油微胶囊;鱼油微胶囊充分固化后,分离出湿微胶囊,用蒸馏水洗去表面残留氯化钙,用乙醇梯度脱水干燥后密封包装。本发明所采用的原料均符合GB/T 19630.2附录列表要求,并在低温和N2条件下制备鱼油或DHA或EPA微胶囊;制备的产品符合有机食品加工标准;微胶囊结构形态良好,表面致密、颗粒均匀,包埋率高,无残油,并具有超强的稳定性;为拓宽鱼油微胶囊的应用及解决有机食品加工难题具有重要意义。
[硕士论文] 王方
食品工程 华中农业大学 2016(学位年度)
摘要:果胶酶因可以彻底的使果胶分解,改变水果的榨汁难度,提高果汁的质量,被广泛用于果汁果酒行业。然而存在用量大、回收困难等现实问题,固定化酶可以在一定程度上弥补这一缺陷。针对锐孔法等制备海藻酸钙微球的缺陷,本论文尝试采用内源乳化法制备微球并对果胶酶进行包埋,探究其对果汁的澄清效果及影响,以期得到具有良好效果且回收率较高的固定化酶。
  主要研究内容和结果如下:
  1.研究优化了内源乳化法制备海藻酸钙微球的工艺条件并对微球进行相关表征。选择海藻酸钠质量浓度、搅拌速度、Span80质量分数等六个因素,通过单因素实验与正交实验相结合的方法,以粒径为主要指标进行考察,得到微球的最佳制备工艺条件为:水相体积分数30%、海藻酸钠质量浓度4.5%、Span80质量分数3%、搅拌速度400r/min、W(Ca):W(Alg)=13.0%、n(HAC):n(CaCO3)=3:1,并采用乙醇梯度脱水-真空干燥法对微球进行干燥。在此条件下制备得到的微球球形度良好,其粒径值为38.02±0.24μm,粒径分布较窄,粒径较为均一,并且具有较好的贮藏稳定性。
  2.探讨了海藻酸钙微球固定化果胶酶的制备及各因素对固定化酶酶活回收率的影响,通过单因素实验与响应面实验相结合的方法得到果胶酶的最佳固定化条件为:海藻酸钙微球质量0.5g,在pH为3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中浸泡溶胀,添加5mg/mL的果胶酶液7.8mL,固定化温度为40℃,固定化时间为6.3h。经酶学性质的研究发现:果胶酶的最适温度及pH值在固定化后均发生了变化,固定化果胶酶对高温的承受能力更强。
  3.评价了固定化果胶酶在苹果汁澄清中的应用。通过单因素实验与响应面实验结合的方法优化得到了固定化酶澄清苹果汁的最佳澄清条件为:20mL的待澄清苹果汁,在苹果汁的pH条件下,加入9mL用pH=3.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分浸泡的固定化果胶酶,澄清温度为45℃,澄清时间90min。通过对苹果汁理化指标的分析证实经固定化果胶酶处理后的苹果汁透光率较高、色值较小,所得苹果汁更为澄清透明,并且澄清处理的苹果汁具有良好的热稳定性及冷冻稳定性。
[硕士论文] 王方
食品科学 华中农业大学 2014(学位年度)
摘要:课题以鲫鱼为原料采用顶空固相微萃取结合气质联用法检测并鉴定鲫鱼鱼肉的挥发性成分,同时研究了酸碱处理对鲫鱼鱼腥味、土霉味的脱除效果,酸碱处理对鲫鱼鱼糜凝胶特性及在-18℃贮藏过程中的稳定性的影响。本研究可为鲫鱼鱼糜加工业的发展提供理论基础。研究结果如下:
  1.鲫鱼鱼肉中检测到24种挥发性物质,包括醇、醛、酮、碳氢化合物等,其中醇、醛和酮化合物对鲫鱼鱼腥味贡献较大,有1-辛烯-3-醇、己醇、辛醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E,E-2,4-庚二烯醛、2,5-辛二酮等,而碳氢化合物和其他物质对鱼腥味的贡献较小。GEO和MIB是鲫鱼鱼肉土霉味的主要物质,它们在鲫鱼鱼肉中的保留时间分别是22.46min和16.26min。
  2.鲫鱼鱼肉蛋白在pH=3.0和pH=12.0时溶解度最大,在pH=5.5时溶解度最低,以此作为酸碱法脱腥处理的pH条件。鲫鱼鱼肉经水洗、酸法(pH=3.0)和碱法(pH=12.0)处理后:E,E-2,4-庚二烯醛被完全除去;己醛的百分含量从15.44%分别降到9.41%、3.41%和3.37%;1-辛烯-3-醇的百分含量从28.35%分别降到14.21%、14.16%和13.00%;己醇的百分含量从21.97%分别降到4.33%、1.87%和1.87%;其他挥发性物质的百分含量也有不同程度的降低。GEO的脱除率分别是53.83%、71.03%和75.38%;MIB的脱除率分别是22.63%、80.31%和82.87%。因此,酸碱处理能够显著去除鲫鱼的鱼腥味和土霉味,而且比水洗法脱腥效果更好。电子鼻可以区分鲫鱼鱼肉与水洗鱼糜、酸法鱼糜和碱法鱼糜的挥发性成分,PCA结果表明两两不同样品的挥发性成分有差异,与气质联用仪检测的结果基本吻合。
  3.经酸碱处理后,鱼糜的水分含量、脂肪含量和灰分含量降低,蛋白质回收率明显提高;SDS-PAGE结果显示鱼糜的肌球蛋白重链的浓度略微下降,碱鱼糜的肌动蛋白的浓度高于酸鱼糜和水洗鱼糜;鱼糜的动态流变特性发生了明显的变化;肌原纤维蛋白和肌浆蛋白发生变性,蛋白质提取率低;肌球蛋白和肌动蛋白发生变性,吸热峰没有出现;酸碱处理降低了鱼糜凝胶的白度,增强了鱼糜凝胶的凝胶强度、硬度、胶粘性、咀嚼性和持水力。
  4.穿刺性能和TPA略微下降,水洗鱼糜、酸鱼糜和碱鱼糜在-18℃贮藏过程中脂肪和蛋白质都发生了氧化,但水洗鱼糜的脂肪氧化程度比酸碱鱼糜显著,而蛋白质氧化程度无明显差异,酸碱鱼糜的贮藏稳定性比水洗鱼糜强。
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