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摘要:本文采用Mannich反应合成黄曲霉毒素B1(AFB1)人工抗原,免疫小鼠制备AFB1单克隆抗体.采用直接搅拌法将异硫氰酸荧光素(FITC)标记AFB1抗体,经Sephadex-50凝胶柱纯化,制得FITC-AFB1荧光标记抗体,分析其免疫学特性,从而建立了一种快速灵敏的直接竞争荧光免疫分析方法(FIA)以用于检测中药材中的AFB1含量.结果表明,AFB1-FITC标记抗体的结合比率为4.19.通过对检测体系多项影响因素的筛选优化,FIA检测方法的标准曲线方程为I=33.45 logC +25.55,R=0.9913,线性检测范围1~100 ng/mL,检测限0.69ng/mL,回收率90.4% ~ 106.6%.该方法具有操作简单、快速灵敏、特异性高等特点,可用于中药材中AFB1的分析测定....
摘要:目的:建立快速、灵敏的直接竞争酶免疫分析方法测定中药材中黄曲霉素B1(AFB1)的含量。方法用自制AFB1人工抗原去免疫小鼠,获取AFB1单克隆抗体;采用碳二亚胺法将AFB1单克隆抗体与辣根过氧化物酶偶联制备AFB1酶标抗原,建立直接竞争酶免疫分析方法,并对检测体系的多项影响因素进行选择优化。结果该方法在1~100μg/L浓度线性关系良好(R=0.9934),标准曲线方程为I=18.41 logC+14.54,检测限为1.98μg/L,回收率为84.6%~92.8%。结论建立的AFB1免疫学快速检测方法操作简便、快速灵敏且选择性好,可用于中药材中AFB1的含量测定。...
摘要:利用金纳米颗粒、黄曲霉毒素B1(AFB1)多抗和互补纳米金探针链、条形码DNA链制备纳米金探针(NP),纯化后进行透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见光谱(UV-vis)和浓度鉴定.将其与黄曲霉毒素B1单抗修饰的磁性微球探针(MMP)通过抗原抗体作用连接,制备MMP-AFB1-NP三明治复合物结构,利用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测在高温低盐条件下解链的条形码DNA,通过考察反应结束后每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数值与相应起始模板拷贝数之间的线性相关程度,建立黄曲霉毒素B4的生物条形码检测方法,并对检测体系进行了方法学评价.结果表明,本实验所建立的方法具有快速灵敏、特异性高等特点,每个模板的循环数值与该模板的起始拷贝数的对教具明显的线性关系y=-2.9054x+54.581,r=0.9991,检测灵敏度远远超过酶联免疫吸附法(ELISA)可达10-8 ng/mL,批间批内差值匀小于5%,用建立的生物条形码检测方法(BCA)对结构类似物进行特异性交叉试验,特异性良好.本法可用于花生、腰果等坚果类食品中AFB1的痕量检测....
摘要:目的:研究黄芩素在纳米金修饰电极上的电化学行为,建立对其测定的电化学分析方法.方法:该文采用循环伏安法和差示脉冲伏安法研究了黄芩素在纳米金修饰电极上的电化学行为,具体考察了支持电解质和缓冲溶液的pH及扫速等测定条件.结果:在pH 6.0的PBS缓冲溶液中,黄芩素氧化峰电流Ⅰ与其浓度C在1.25×10-7~6.98×10-6 mol/L范围内呈良好的线性关系,线性方程为Ip=0.0414x(C黄芩素)+0.8159,r=0.9956,依据LOD=3 σ/S,该方法的检测限为4.56×10-8 mol/L.结论:该方法操作简便,灵敏度高,可用于实际样品中黄芩素的直接测定....
摘要:目的 应用石杉碱甲(HupA)对[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-([Fe(CN)6]3-/4-)体系的氧化还原作用建立石杉碱甲电化学检测的新方法.方法 采用循环伏安法和差示脉冲伏安法研究了石杉碱甲存在情况下[Fe(CN)6] 3-/4-体系的电化学行为,具体考察并优化了支持电解质、缓冲溶液的pH以及扫速等测定条件.结果 在pH 7.0的0.1 mol/L KCl-10 mmol/L K3Fe(CN)6-0.1 mol/L PBS体系中,HupA抑制的峰电流AIp与其浓度的对数值在1.00×10-7~ 4.76×10-5 mol/L范围内呈良好的线性关系,线性方程为AIp(μA)=14.19×lgCHupA(μmol/L)+14.16,线性回归系数r=0.9949.依据3σ/s计算本方法的检测限为8.82×10-8 mol/L.结论 该方法操作简便,灵敏度高,可用于实际样品中石杉碱甲的测定,其结果与高效液相法所得结果一致,效果令人满意....
摘要:采用石墨烯-壳聚糖复合膜修饰玻碳电极(GR-CS/GCE),共价固定黄曲霉素B1(AFB1)单克隆抗体,建立检测AFB1的电化学免疫传感器分析方法.在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中,利用循环伏安法(CV)和差示脉冲伏安法(DPV)研究[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-([Fe(CN)6]3-/4-)氧化还原体系的电化学行为,采用DPV法检测AFB1.在优化实验条件下,AFB1浓度与峰电流差值在0.005~10ng?mL-1范围内呈良好的线性关系,线性方程为Δip = 2.1306 C+8.4793(R2=0.994),检出限为1.47×10-3ng?mL-1.
[硕士论文] 王彤颖
药物分析学 福建中医药大学 2017(学位年度)
摘要:石杉碱甲(HupA)是一种高效且可逆的乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,是目前治疗老年痴呆症(又称阿尔茨海默病,AD)最有前景的药物。随着世界人口老龄化的加快,阿尔茨海默病患者逐年增加,国内外对其需求量日益增加。当前医学界尚没有发现合适的HupA替代品,人工合成法也局限于实验室使用,目前HupA主要从石杉属和马尾杉属等植物中提取获得,然而该类植物野生资源匮乏,且HupA含量甚微。因此建立高灵敏度的HupA检测方法,对充分利用该类资源具有十分重要的现实意义。
  近年来,纳米技术发展迅速,尤其是纳米金标记技术备受业界关注。该技术具有简便、快速、准确及无毒等优点,为药物的分析测定提供一种新的研究思路。纳米金的表面积大、生物兼容性好,其表面能够通过静电作用与抗体、酶等生物大分子相结合,还可以与巯基或PolyA修饰的DNA相结合,形成探针后后生物分子的活性基本不受影响,且性质较为稳定,这些功能化的纳米金探针用于免疫分析中,可显著提高方法的检测灵敏度。免疫磁珠(磁珠探针)是近年来新兴的一种功能材料,指偶联了抗原或抗体的磁性微球。磁珠具有较强的磁响应性,通过引入磁场,可以实现快速分离、富集目标物,具有操作简便、快速高效和不影响生物活性等优点,在免疫分析领域、细胞分离等方面具有独特的优越性。
  本论文利用纳米金探针和磁珠探针的特性,以竞争免疫分析为基础,研发了检测HupA的新型酶标免疫分析方法,并应用于实际样品的含量测定,为药物中有效成分的微量测定提供新的分析策略。论文共分为三章,主要内容如下:
  第一章:酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  采用柠檬酸三钠还原法合成纳米金,将酶和抗体修饰于纳米金颗粒表面制备纳米金探针,并对探针制备条件进行优化,如标记pH、最适抗体标记量、酶和抗体标记比例等,采用紫外分光光度法和透射电镜对制备好的纳米金探针进行表征。将制备好的纳米金探针引入到免疫分析中,采用竞争免疫分析模式,建立了一种检测HupA的新方法。并对实验条件如包被抗原和纳米金探针稀释比例、最佳竞争反应时间进行了优化,在最佳实验条件下,该方法测定HupA的线性范围为0.5~150ng/mL,线性方程为I=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960),检测限为602.56 pg/mL。将该法应用于蛇足石杉中HupA含量测定,经国标法验证,二者测定结果基本一致,回收率在97.08~106.11%之间,结果较好。该法检测时间短,灵敏度高且重复性好,是一种简便、高效、经济的检测体系,有利于推广应用。
  第二章:磁珠和酶标纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  本研究引入磁性载体-磁珠,代替传统的96孔酶标板,将石杉碱甲完全抗原(HupA-OVA)标记在磁珠上。基于磁性分离,利用纳米金探针,建立了快速、高效、灵敏度高的检测石杉碱甲的酶标免疫新方法。考察并优化了磁珠探针和纳米金探针的稀释比例、最佳竞争反应时间等免疫分析条件,最终确立了检测体系,在优化实验条件下,该方法在HupA浓度为0.075~180ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950),检测限为160.32 pg/mL。将该法应用于石杉碱甲片剂含量测定,检测结果与国标法所测结果基本一致,该方法的灵敏度较前一种方法更高、线性范围更宽且缩短了检测时间。
  第三章:磁珠和DNA-纳米金探针检测石杉碱甲的方法研究。
  在前两种方法研究的基础上,基于磁珠建立了DNA-纳米金探针检测方法,并对该方法的精密度、重复性、专属性等进行了考察,结果均在允许范围内,该方法在HupA浓度为0.008~16 ng/mL之间,抑制率与HupA浓度的对数值lgC呈良好的线性关系,线性方程为I=0.3006 lgC+0.6142(r=0.9952)检测限为19.41pg/mL。并对蛇足石杉内生真菌发酵液中HupA进行了检测,加标回收率在99.33~103.73%之间,结果令人满意。DNA的引入进一步提高了方法的灵敏度,此方法较前两种方法灵敏度更高。
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