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[硕士论文] 王岳
作物遗传育种 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:在油菜杂种优势利用实践中,甘蓝型油菜(Brassica napus L.)波里马细胞质雄性不育(polima cytoplasmic male sterility,简称pol CMS)是油菜最重要的雄性不育类型之一。杨光圣等(1995,1998)在两个甘蓝型油菜品种杂交后代中发现了低温可育、高温不育的温敏型波里马细胞质不育(Temperature-sensitive polima cytoplasmic male sterility,简称pol TCMS)现象。借在此基础上,选育出制种产量高、容易繁殖的pol TCMS两用系,并陆续组配“华油杂10号”等几十个通过国审或省审的杂交油菜新品种。这表明pol TCMS具有广阔的应用前景。
  杨光圣等(1997)对pol TCMS进行了较深入的研究,结果显示细胞核中的多个数量基因可能调控其温度敏感性。为了进一步深入研究pol TCMS的育性转换机制,本研究将温度敏感型不育系(Y402)和稳定可育型(Rf48)两种甘蓝型油菜在花芽分化的关键时期,分别置于25℃和10℃条件下培养,在育性转换的关键时期提取0.5mm花蕾RNA。通过转录组分析,对比鉴定出温度特异调控pol TCMS育性转换的相关基因;同时结合pol CMS恢复基因研究进展,初步探讨了pol TCMS受温度调控的分子机制。
  结果总结如下:
  1、通过Illumina HiSeq-150平台测序产出Raw data共155.893G,过滤后获得Clean data共154.736G。通过Hisat2将Clean data与甘蓝型油菜中双11的参考基因组进行比对,比对率在90%左右。通过StringTie进行转录本组装得到199589个unigenes,总长度267Mbp。
  2、研究中通过联合使用Ballgown和DEseq2进行差异表达基因分析,将高温样本与低温样本进行比较,以FDR<0.01,差异表达倍数2倍以上(即|Log2Ratio|>1)为阈值并过滤掉低质量unigenes,共得到Y402差异表达基因910个,其中上调基因439个、下调基因471;Rf48差异表达基因1808个,其中上调基因990个、下调基因818个。
  3、用Blast2GO对Y402的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析发现,高温环境下Y402下调基因功能集中在细胞组成、合成代谢、生殖生长三类,上调基因功能集中在光合作用、氧化还原反应等能量供给相关分类。KEGG富集分析结果与GO富集分析结果一致,并富集到pol CMS育性变化相关基因orf224/atp6所在的氧化磷酸化途径。该途径存在一个重要基因MSTRG.5508.4,其在高温环境下沉默,在低温环境下有较高表达量,认为其可能是本研究中高温环境下造成pol TCMS育性转化的关键基因。
  4、通过双重比对的方法,在Y402差异表达基因中筛选与育性相关基因。结果发现pol CMS育性保持基因rfp在高温下表达量下调;在生殖生长阶段赋予花蕾耐热性的基因SPL1和SPL12在高温下表达量下调;在减数分裂前期调控花药发育相关基因ROXY1、MYB65和ER等在高温下表达量下调。
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