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[博士论文] 王佃科
眼科学 山东大学 2017(学位年度)
摘要:青光眼由于眼压增高而引起视盘(曾称视乳头)凹陷、视野缺损,最终可以导致失明的严重眼病。microRNA在青光眼的发生发展的过程中发挥着重要调节作用,譬如miR-29家族,miR-204,miR-24,以及miR-184。miR-184最早由Lagos-Quintana等在小鼠心脏和小脑中发现,定位在9号染色体上, miR-184在局部缺血性疾病对血管新生具有显著的调节作用,通过与其靶标VEGF和IGF-2结合,抑制VEGF和IGF-2表达,从而减少新生血管的生成。miR-184在舌鳞状细胞癌、恶性胶质瘤等多种肿瘤的发生发展过程中也发挥着重要的作用。
  有研究表明miR-184能够通过调控Akt信号通路,TNF-α信号通路,以及VEGF实现对血管生成能力的调控。已经有学者发现在很多视力障碍的患者体内均存在miR-184表达水平降低的现象。圆锥角膜患者的角膜及小梁网组织相比于睫状体及视网膜组织中miR-184表达水平较高,这表明miR-184可能在预防视神经疾病的过程中发挥着重要作用。氧化应激损伤引发细胞凋亡进而诱导视觉神经组织的损伤,是青光眼、白内障、老年性黄斑变性等疾病的主要诱因之一。我们通过体外培养人小梁网细胞,并模拟氧化应激损伤,探究miR-184调控人小梁网细胞生长、凋亡及氧化应激所致细胞毒性的分子机制,为早日发现治疗青光眼的治疗靶点提供理论基础。
  第一部分 慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平变化
  目的:
  探讨慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平变化情况。
  方法:
  在体外分离培养人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,在体外模拟慢性氧化应激环境。探究相比于正常培养条件下的人小梁网细胞,慢性氧化应激刺激的条件下miR-184的表达水平差异。
  结果:
  1.在正常培养条件下及慢性氧化应激条件下的人小梁网细胞的形态无明显差别。
  2.在慢性氧化应激条件下人小梁网细胞中miR-184水平相比于正常培养条件下人小梁网细胞中miR-184水平有十分显著的下降,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  3.慢性氧化应激条件下,转染miR-184的模拟剂,相比于阴性对照组,人小梁网细胞中的miR-184表达水平显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);转染miR-184的抑制剂,相比于抑制剂阴性对照组,人小梁网细胞中的miR-184表达水平显著下降,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  结论:
  在慢性氧化应激条件下,人小梁网细胞中miR-184水平显著下降,miR-184对人小梁网细胞具有重要的调控作用。
  第二部分 miR-184在氧化应激条件下对人源小梁细胞的生长、凋亡、细胞毒性的影响
  目的:
  探讨氧化应激条件下miR-184对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性的调控作用。
  方法:
  为了更好体现实验的重复性和科学性,在体外分离培养来源于两个不同个体的人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,存体外模拟慢性氧化应激环境,探究在氧化应激条件下,人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分变化。使用miR-184的模拟剂及抑制剂探究miR-184对人小梁网细胞凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分的影响。统计学分析:采用SPSS19.0统计学软件(SPSS Inc.,USA)进行统计学分析,所有数据采用平均值±SD值表示。两组间比较采用t检验,三组及以上采用单因素方差分析,检验水准设置为0.05,当P<0.05时两组间差异具有统计学意义。使用Graphpad Prism6.0(GraphPad Software Inc,La Jolla,CA)软件作图分析。
  结果:
  1.两株人小梁网细胞系在慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞毒性均有显著的上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的细胞毒性上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的细胞毒性,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  2.两株人小梁网细胞系在慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞早期凋亡水平均有显著的上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的早期凋亡水平上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的早期凋亡水平,且结果具有统计学差异(p<0.05).
  3.过表达miR-184模拟剂,凋亡相关蛋白Bax蛋白、剪切形式的Caspase-3的蛋白及mRNA表达水平均显著下降,且结果具有统计学差异(p<0.05);转染miR-184抑制剂,凋亡相关蛋白Bax蛋白、剪切形式的Caspase-3的蛋白及mRNA表达水平均显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  4.在人小梁网细胞中慢性氧化应激条件下,相比于正常条件下的人小梁网细胞,细胞外基质蛋白COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白,COL5A1蛋白,SPARC蛋白的mRNA及蛋白表达水平均显著上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在小梁网细胞中表达miR-184的模拟剂能够显著抑制由慢性氧化应激条件引起的细胞外基质蛋白(COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白,COL5A1蛋白,SPARC蛋白)表达水平上升,且结果具有统计学差异(p<0.05);在人小梁网细胞中表达miR-184的抑制剂,能够显著的提高人小梁网细胞的细胞外基质蛋白(COL1A1蛋白,COL1A2蛋白,COL3A1蛋白, COL5A1蛋白,SPARC蛋白)表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05).
  结论:
  氧化应激条件下miR-184对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性具有调控作用。
  第三部分 miR-184通过作用于HIF1α实现在氧化应激条件下对人源小梁细胞的生长、凋亡、细胞毒性的调控
  目的:
  研究在氧化应激条件下miR-184通过调控HIF-1a实现对人小梁网细胞的细胞凋亡、毒性及细胞外基质蛋白表达水平调控情况。
  方法:
  在体外分离培养人小梁网细胞,将人小梁网细胞在40%氧气,5%二氧化碳的环境中培养五天,在体外模拟慢性氧化应激环境。探究相比于正常培养条件下与慢性氧化应激刺激的条件下人小梁网细胞miR-184的表达水平差异。并探究在氧化应激条件下,人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分变化。使用miR-184的模拟物及抑制剂探究miR-184对人小梁网细胞凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分的影响。我们接下来发现miR-184可以直接结合HIF1α的启动子区域实现对HIF1α的抑制,并通过HIF1α实现了对人小梁网细胞的凋亡水平,细胞毒性及细胞外基质成分改变的调控。
  结果:
  1.使用http://www.targetscan.org/vert_71/)对miR-184结合HIF1-a mRNA的3' UTR结合位点进行预测。
  2.转染miR-184的模拟剂后,能够显著地抑制HIF-1a3' UTR的荧光报告酶活力,且结果具有统计学差异(p<0.05)。这表明miR-184可以结合HIF-1a的3' UTR,并抑制HIF1a的表达。而突变掉预测结合位点后,转染miR-184的模拟剂后,对HIF-1a3' UTR的荧光报告酶活力无明显影响,这表明miR-184结合的HIF-1a3'UTR位点为之前预测的位点。
  3.在人小梁网细胞中转染miR-184模拟剂,能够显著地抑制HIF-1a mRNA表达水平及蛋白表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05)。在人小梁网细胞中转染miR-184抑制剂,能够显著地提高HIF-1a mRNA表达水平及蛋白表达水平,且结果具有统计学差异(p<0.05)。
  4.HIF-1a慢病毒knockdown质粒转染人小梁网细胞,免疫荧光及免疫分析化学检测结果显示:HIF-1a的表达水平显著降低。
  5.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞毒性的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞毒性有显著的下降。
  6.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞凋亡的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞凋亡有显著的下降。
  7.在氧化应激条件下,当转染miR-184的抑制剂,能够显著地促进由氧化应激引起的人小梁网细胞的细胞外基质蛋白表达水平的上升,当同时转染HIF-1a慢病毒knockdown质粒后,人小梁网细胞的细胞外基质蛋白表达水平有显著的下降。
  结论:
  氧化应激条件下miR-184能够通过抑制HIF-1α实现对人小梁网细胞生长、凋亡及细胞毒性的调控,miR-184可以作为治疗青光眼的潜在治疗靶点。
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