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摘要:生物被膜是细菌及其自身分泌的胞外聚合物组成的微生物群落,其形成是受多种机制共同调控的多阶段动态过程,具有较强的耐药性且难以清除,给医疗、食品等行业带来了巨大的威胁.近年来,生物被膜的相关研究领域备受关注,尤其是针对生物被膜的有效检测技术.本文在简要介绍生物被膜的特点、形成过程及群感效应对生物被膜的调控作用基础之上,总结了生物被膜常用的检测方法,重点针对电化学阻抗技术在生物被膜检测中的应用进行调研和讨论,并对基于微流控芯片的生物被膜电化学阻抗原位检测进行了综述和展望....
[专利] 发明专利 CN201710653527.8
重庆大学 2017-12-01
摘要:本发明属于细菌检测技术领域,具体涉及一种新型便携式细菌实时检测芯片系统及检测方法,所述检测系统集成荧光检测功能和介电电泳富集功能于一体,既能够实现目标菌在微型芯片内的高度富集,提高检测灵敏度、降低目标细菌检出限,又能够实现细菌的原位高精度检测。此外,还能够在检测系统内部直接完成检测分析和数据输出,实现细菌的便携式实时检测。所述检测方法灵敏度高、准确度好,且操作简单方便,适用多种不同环境下细菌浓度检测。
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CSTPCD 北大核心 SCI
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摘要:微流控芯片分析技术可以集成不同的生物化学分析功能单元,广泛应用于生化分析领域,在细菌检测方面具有传统检测方法不可比拟的优越性.近来年,在微流控细菌芯片中引入高荧光强度、低背景荧光干扰和高选择性的纳米荧光探针为实现细菌高效检测分析提供了新的研究途径和技术手段.本文通过对细菌检测中的几类新型荧光标记探针的介绍和比较,分析其荧光效应和应用特点,尤其是在细菌检测中的应用特性,重点综述了新型高效的纳米荧光探针与微流控细菌芯片分析方法和技术结合,实现微尺度空间和荧光检测模式下的细菌高效检测....
[专利] 发明专利 CN201610505475.5
重庆大学 2016-12-07
摘要:本发明公开了一种快速富集分离检测细菌的方法,包括以下步骤:(1)将待测样品与磁珠混合,振摇孵育后进行磁分离,将磁分离后的磁珠重悬于PBS溶液中,得到残余磁珠和吸附有细菌的磁珠悬浮液;(2)在分离管中加入配置好的凝胶,再将步骤(1)得到的悬浮液置于凝胶上,然后进行磁分离;(3)磁分离完成后,通过肉眼观察分离管底部的黑色沉淀,对结果进行定性分析,或建立不同浓度的标准样品分离得到的黑色沉淀量与标准样品浓度的对应关系,再将待测样品分离得到的黑色沉淀量与其对照,判断待测样品中含菌量的范围。本发明能实现复杂样品中细菌的快速分离,对细菌含量在102CFU/mL及以上的样本进行快速识别和半定量判定。
[博士论文] 王人杰
化学工程与技术 重庆大学 2017(学位年度)
摘要:高效细菌检测方法的研究与建立在食品安全、环境卫生和生物医疗等领域的重要性不言而喻。将荧光检测技术和阻抗检测技术与微流控芯片(Microfluidic chip)有效集成以构建新型微型化分析平台,具有实现快速、高效、灵敏细菌检测及检测系统微型化和集成化的潜力,在细菌检测领域具有广阔的发展前景。
  本论文针对目前细菌检测耗时长、过程繁琐、灵敏度较低、依赖大型检测仪器等问题,提出将微流控细菌芯片与原位荧光检测技术及电化学阻抗检测技术集成,构建微型化分析检测微系统,并有机结合纳米技术放大检测信号的总体研究方案。为避免传统荧光标记试剂易淬灭、不易修饰等缺点,设计制备了荧光产率高、生物相容性好的荧光纳米粒子;通过对各功能区流场和电场的计算模拟,确定集成特异性富集功能和介电电泳(DEP)分选富集功能的微流控细菌芯片的主要功能区结构;完成微流控芯片功能区内细菌的分离与富集、纳米粒子标记、细菌原位荧光和电化学阻抗检测信号放大以及细菌检测方法研究,建立基于微流控芯片的细菌高效检测方法,在细菌的快速检测集成化和实时化发展方面具有重要研究价值和应用前景。
  本文主要研究工作及结果包括:
  ①综述了细菌检测需求背景和意义、微流控芯片细菌检测技术以及微流控芯片在其他生化领域应用的发展现状和趋势,对目前细菌检测方法所存在的问题进行进一步的分析,提出本文的研究目的与主要研究内容。
  ②基于荧光标记法对D-柠檬烯纳米乳液的细菌生物膜抑制效应的研究,分析并提出了细菌检测的明确需求。实验基于有机荧光试剂标记,初步探索了D-柠檬烯纳米乳液对细菌生物膜的抑制作用,发现建立快速灵敏高效的细菌检测方法十分重要,而纳米技术与多功能微流控芯片的有机集成将是新方法建立的有效途径。③建立了沙门氏菌芯片原位荧光检测新方法,研制了集成免疫捕获-CdSe/ZnS量子点标记及DEP富集的沙门氏菌微流控芯片。通过设计制作集成特异性富集功能的微流控细菌芯片,解决细菌芯片分析体系的选择性问题;通过设计制作集成DEP分选富集功能的微流控细菌芯片和原位荧光检测,有效提高了细菌芯片检测的灵敏度,还可以实现细菌的芯片可视化观测。以亲水性CdSe/ZnS量子点作为荧光标记物,构建集成微流控荧光检测微系统,对固定于微流控芯片免疫反应区的 QDs标记的鼠伤寒沙门氏菌产物进行荧光检测,实现鼠伤寒沙门氏菌的定量分析,对鼠伤寒沙门氏菌的检测限达到37cfu mL-1。为充分发挥疏水性CdSe/ZnS量子点在细菌检测领域的优势,以改进的反相微乳液法制备CdSe/ZnS@SiO2-NH2壳层结构纳米粒子,利用戊二醛“两步法”将CdSe/ZnS@SiO2-NH2壳层结构纳米粒子标记于细菌表面,建立了沙门氏菌定量测试方法。为降低细菌的检出限和获取可视化检测效果,利用CdSe/ZnS@SiO2-NH2纳米粒子标记后的沙门氏菌的介电泳特性,在集成DEP分选富集功能的微流控细菌芯片上,以正介电电泳(pDEP)模式,将沙门氏菌(5cells/25μL)捕获富集于微电极边缘,在荧光显微镜下可以实现极少量细菌的可视化计数观测。
  ④建立了集成CQDs-apt新型纳米荧光标记和DEP在线分选富集的沙门氏菌微流控芯片检测新方法。设计并制备了制备简单生物相容性高的CQDs,并与适配体(apt)结合,研制获得具有优越荧光性和特异性的新型纳米荧光探针;利用该荧光探针,在优化的条件下,无需其他富集操作,建立了沙门氏菌高效定量检测新方法,方法对沙门氏菌的最低检出限达到50cfu mL-1。在适配体特异性的识别标记沙门氏菌的基础上,将该荧光标记体系与微流控芯片上DEP技术有机结合,实现对样本中活性沙门氏菌的DEP分选富集和荧光定量检测,所建立的细菌检测方法将检测时间缩短在两个小时以内,兼具高效、灵敏、易集成等优点,在生化分析和药物筛选等领域具有巨大的应用潜力。
  ⑤建立了集成DEP富集和原位电阻抗检测的大肠杆菌微流控芯片检测新方法。设计制备了具有DEP富集和原位电阻抗检测的多功能微流控细菌芯片,搭建集成微流控芯片阻抗分析微系统,通过芯片上集成叉指微电极实现细菌的在线预富集和原位阻抗在线监测,解决了提高细菌检测灵敏度及芯片上细菌在线检测的难题,建立了微流控芯片介电电泳富集-原位阻抗检测的细菌定量新方法。以大肠杆菌为测试样本细菌,在优化的条件下,方法对大肠杆菌的检测限为5×104cfu mL-1,检测时间仅为6min,并成功应用于鸡肉合成样本中大肠杆菌检测,证明了该方法的实际应用潜力。在充分发挥细菌阻抗检测优势的基础上,为降低细菌检出限,进一步设计制备了集成“Tesla”结构混合区和叉指微电极的微流控阻抗检测芯片,利用AuNPs@Ag复合物的电信号放大作用,建立了能快速有效提高细菌阻抗检测灵敏度的方法,从而将基于微流控芯片的细菌阻抗检测方法检出限降低为5×102cfu mL-1。
摘要:本文建立了基于微流控DEP芯片分析系统的死-活鼠伤寒沙门氏菌的分选新方法.分析系统主要由微流控DEP芯片、交流信号发生器、倒置显微镜、CCD成像系统等构成.DEP 芯片由载有金叉指电极的玻璃基底和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)盖片两部分组成.叉指电极共有50根微电极,每根电极宽度为30μm,电极间距为20μm.鼠伤寒沙门氏菌经高温高压灭菌后,得到灭活鼠伤寒沙门氏菌.以去离子水为缓冲液,分别以浓度为2.62×106 cfu mL-1的死、活鼠伤寒沙门氏菌为样品,在1.0 μL min-1的进样流速下分别将死活鼠伤寒沙门样本通入DEP芯片的电极区,对其施加不同的介电信号(交流电压和激发频率),用倒置显微镜观察死、活鼠伤寒沙门氏菌在微电极上的富集情况.结果显示,当交流电压峰峰值为6V,激发频率小于5 MHz时,死、活鼠伤寒沙门氏菌均可被富集到微电极边缘,激发频率等于5 MHz时,活鼠伤寒沙门氏菌可被富集到微电极边缘,而灭活鼠伤寒沙门氏菌不能被富集.这是因为灭活细菌的细胞膜会出现穿孔现象,降低了细菌的介电常数.随着激发频率的上升,细菌的介电常数减小,当细菌的介电常数减小到与缓冲液相等时,细菌在该激发频率条件下不受介电电泳力作用,不会被富集到微电极周围.由于灭活的鼠伤寒沙门氏菌的介电常数比活鼠伤寒沙门氏菌的介电常数低,在随着激发频率上升介电常数降低的过程中更容易减小到与缓冲液相等,故当交流电压和进样流速等其他条件一定时,会有一个频率使死细菌不受介电电泳力作用,而仍能使活细菌受到正介电电泳力的作用,从而达到分选富集死、活鼠伤寒沙门氏菌的目的.该方法对于细菌学研究和临床应用具有重要意义.
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