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[博士论文] 特发叶·沃酷
动物遗传育种与繁殖 华中农业大学 2018(学位年度)
摘要:本论文试验研究由三部分组成。第一部分分析肝配蛋白A5(EphrinA5)在小鼠颗粒细胞中的生理作用和信号转导途径;第二部分探讨肝配蛋白A5的全基因组效应;第三部分分析鼠源肝配蛋白A5及其受体蛋白结构。
  实验Ⅰ:肝配蛋白A5对小鼠原代颗粒细胞凋亡和增殖的调控作用及新的信号通路
  最新研究结果表明,肝配蛋白A5除了作为神经发生因子发挥生理作用外,还在雌性小鼠繁殖过程中具有重要生物学作用,但在颗粒细胞(GC)中的生物学作用尚不清楚。GC是研究卵泡发育基因功能和调控网络的理想模型。本研究结果表明,肝配蛋白A5的表达在各年龄组小鼠GC中有差异。干扰肝配蛋白A5基因引起mRNA水平和蛋白质水平表达下调,同时抑制E游受体EphA5、Epha3、Epha8和Ephb2的mRNA表达。在体外水平,肝配蛋白A5的下调表达抑制小鼠GC细胞凋亡过程。为了揭示肝配蛋白A5在调控GC凋亡中的作用,本研究进一步分析凋亡因子mRNA和蛋白水平的表达情况,发现Bax、Tnfα、Caspase-8和Caspase-3表达下调,而Bcl-2表达上调。这些结果表明,肝配蛋白A5通过Caspase-8介导的内源性途径参与细胞凋亡。进一步敲低肝配蛋白A5的表达水平,引起Pcna表达上调,随后激活p-Akt和p-ERK途径来,促进GC增殖。此外,抑制肝配蛋白A5可增强BMH15、VEGFA和雌二醇mRNA表达水平,并且在不影响孕酮表达水平的情况下抑制GDF9表达,说明其参与卵泡血管生成和卵母细胞发育调控。综上所述,肝配蛋白A5调节雌性小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇生成过程,因此是雌性生育障碍的潜在治疗靶标。
  实验Ⅱ:小鼠颗粒细胞肝配蛋白A5干扰后的转录组分析
  肝配蛋白A5是一种肝配蛋白-乙二醇苯醚(ephrin-Eph)信号分子,主要是神经元因子。但最近的研究表明其生理作用超过了神经发生,其在雌性生殖功能中尤其在卵泡发育中的作用日益受到关注。肝配蛋白A5与繁殖相关的研究处于初始阶段,目前尚未从转录组水平报道肝配蛋白A5在卵巢颗粒细胞中的作用。本研究研究利用肝配蛋白A5的siRNA处理小鼠颗粒细胞,然后进行转录组测序(RNA-Seq),以探索肝配蛋白A5干扰后颗粒细胞的全基因组图谱。RNA-Seq分析结果表明,在小鼠颗粒细胞中检测到16389个基因,与阴性对照相比,siRNA处理的细胞中有208个基因失调。其中,149个基因下调,59个基因上调。失调的基因主要富集在细胞外过程、钙结合和细胞粘附。此外,它们主要参与了PI3K-Akt信号转导途径、细胞因子-细胞因子受体相互作用、局灶性粘附和Rap1信号转导途径等过程。总体而言,干扰肝配蛋白A5改变了调节卵泡发生的十多种基因的转录水平、调控网络和生物学过程。本研究为肝配蛋白A5在神经生物学外的雌性生殖中的作用研究提供了新的线索和研究思路。
  实验Ⅲ小鼠肝配蛋白A5及其受体的结构分析
  蛋白质结构对于细胞功能至关重要,因此结构的缺陷可能导致细胞功能紊乱。肝配蛋白A5受体属于介导细胞通讯过程中最大的一类酪氨酸激酶家族。通过NCBI和蛋白质资源数据库中检索肝配蛋白A5(Efna5)、肝配蛋白A5受体3(Epha3)、肝配蛋白A5受体5(Epha5)和肝配蛋白A5受体B2(Ephb2)的氨基酸序列,评价和鉴定其蛋白质结构并预测候选蛋白的三维(3D)结构。候选蛋白预测结构存在轻微的构象变化,采用ProSA软件3D分数进一步分析预测模型的精度。Efna5、Epha3、Epha5和Ephb2的Verify3D分数分别为92.75%、94.77%、89.87%和85.96%,说明预测模型结构在可接受质量范围内。蛋白质结果无序性分析表明Efna5、Ephb3和Ephb2分别存在32.89%、25.4%和27.07%的残基紊乱。配体结合位点分析结果表明,Efna5、Epha5、Epha3和Ephb2分别存在3、5、4和2个不同的氨基酸残疾数目的配体分子。此外,预测到候选蛋白非结合区的3个结合位点。距离波动分析发现一些氨基酸残基在下降和上升的波动中均存在。应用互相关函数进一步分析发现这些候选蛋白均存在突变结构。相互作用和通路分析发现鉴定的40个蛋白中有15个蛋白不属于肝配蛋白A5受体家族。CpG岛分析结果表明,候选靶蛋白存在甲基化位点,其中Ephb2预测分数最高。计算机模拟分析靶蛋白的3D结构,为进一步结构分析提供直观信息。此外,候选蛋白一些已经证实结合位点区域为分子嵌合和新药物分子设计提供有力的证据。
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