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[专利] 发明专利 CN201910345204.1
浙江大学 2019-08-16
摘要:本发明公开了一种家蚕表达重组蓖麻毒素蛋白A链的方法。以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板PCR处理获得蓖麻毒素蛋白A链基因的PCR产物;利用家蚕核型多角体病毒BmNPV作为载体,构建了含有蓖麻毒素蛋白A链基因的重组病毒,利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主表达具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白A链。本发明以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白A链,具有较强的生物活性,有利于蛋白质的快速提取,为该蛋白A链在医学和治疗领域上的应用提供了新的途径。
[专利] 发明专利 CN201910272670.1
浙江大学 2019-07-19
摘要:本发明公开了一种生产重组蓖麻毒素蛋白B链的方法。以蓖麻籽抽提获得的总RNA为模板PCR处理获得蓖麻毒素蛋白B链基因的PCR产物;利用家蚕核型多角体病毒BmNPV作为载体,构建了含有蓖麻毒素蛋白B链基因的重组病毒,利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主表达具有生物活性的重组蓖麻毒素蛋白B链。本发明以家蚕作为宿主生产重组蓖麻毒素蛋白B链,具有较强的生物活性,有利于蛋白质的快速提取,为该蛋白B链在医学和治疗领域上的应用提供了新的途径。
[博士论文] 沈运旺
特种经济动物饲养 浙江大学 2018(学位年度)
摘要:杆状病毒科包含一大类专一性感染昆虫的有囊膜病毒,它们的基因组是环状、超螺旋的双链DNA分子。目前已经在600多种昆虫中分离到杆状病毒,主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫。杆状病毒在其生活周期中,产生两种遗传物质相同,但是形态和功能完全不同的病毒粒子,即出芽型病毒(budded virus,BV)和包埋型病毒(occlusion-derived virus,ODV)。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)只感染家蚕(Bombyx mori),是目前研究最广泛的杆状病毒之一。本研究以BmNPV四个功能未知的ODV相关蛋白ORF40、ORF133/134和ORF92a为研究对象,通过构建基因敲除突变体,发现它们在ODV的形成过程中发挥不同的功能。主要结果如下。
  1.BmNPV ORF40的功能研究
  BmNPV的ORF40(bm40)位于病毒基因组的38,254-39,213nt,在已测序的α杆状病毒基因组中高度保守。bm40的开放阅读框(open reading frame,ORF)全长960bp,编码319个氨基酸残基,预测分子量为37.8kDa。生物信息学分析显示Bm40的N端和C端分别含有一个Dna J结构域和一段RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm40是一个晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了敲除bm40的重组病毒。结果表明,敲除型病毒只能感染单个细胞,无法产生具有感染力的子代BV病毒粒子,但是病毒DNA的复制没有受到影响。电镜结果表明,敲除bm40影响了核衣壳从细胞核转运到细胞质、核衣壳包膜形成ODV病毒粒子,以及随后ODV包埋的过程。共聚焦显微镜分析发现,从感染后48小时,Bm40主要位于细胞核内,并在感染晚期聚集在核膜和多角体上。敲除Bm40的RRM不影响BV的产生和Bm40的细胞内定位。以上结果表明,在BmNPV感染周期中,Bm40在BV的产生和ODV的包膜过程中发挥重要作用。
  2.BmNPV ORF133/134的功能研究
  BmNPV的ORF133(bm133)和ORF134(bm134)分别位于病毒基因组的126,858-127,313nt和127,342-127,671nt。这两个开放阅读框相邻,并且转录方向相反。这两个基因在所有已测序的groupⅠNPV中高度保守,分别编码两种小分子蛋白(Bm133,17.7kDa;Bm134,12.4kDa)。RT-PCR结果表明bm133和bm134均是晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了bm133和bm134同时缺失的重组病毒。结果表明,同时敲除两个基因不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜结果表明,双敲除不影响核衣壳的组装、核内微泡的形成,以及ODV病毒粒子的产生,但是被包埋进多角体的ODV病毒粒子数量显著减少。进一步研究显示单独修复某个基因并不能恢复ODV包埋的能力,表明这两个基因在ODV包埋过程中缺一不可。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm133和Bm134同时位于细胞质和细胞核。在裂解的细胞中,Bm134主要聚集在多角体上。这些结果表明,Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在ODV包埋与多角体形态发生过程中发挥重要作用。
  3.BmNPV ORF92a的功能研究
  BmNPV的ORF92a(bm92a)位于病毒基因组的88,983-89,162nt,在已测序的杆状病毒基因组中高度保守。bm92a的开放阅读框全长180bp,编码59个氨基酸残基,预测分子量为7.1kDa。Bm92a是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的经口感染因子AC110的同源物,在其N端存在一段高度疏水的跨膜结构域(transmembrane,TM)。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm92a是一个晚期表达基因。
  利用λRed同源重组系统构建了敲除bm92a的重组病毒。结果表明,bm92a敲除型病毒和修复型病毒具有类似的增长曲线。电镜结果表明,bm92a敲除不影响核衣壳的组装、ODV的包膜和多角体的形态。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm92a主要位于细胞核内的环形区域,并在感染晚期聚集在多角体上。并且,Bm92a的细胞内转运和定位模式与经口感染因子PIF1和PIF2的类似。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Bm92a与PIF1具有强烈的互作关系。这些结果表明,Bm92a不是BV和ODV产生必需的,它可能通过与PIF1的互作参与经口感染因子复合体的形成。
[期刊论文] 张健家 沈运旺 吴小锋
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CSTPCD 北大核心
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摘要:昆虫杆状病毒在感染宿主的过程中产生2种结构和功能不同,但遗传物质完全一致的病毒粒子表型,即出芽型病毒粒子(BV)和包涵体衍生型病毒粒子(ODV).在昆虫中肠碱性环境下释放出的ODV通过其表面囊膜上高度保守的经口感染因子(PIF)介导感染中肠上皮细胞,引发原发性感染.已有研究发现,由经口感染因子PIF1、PIF2、PIF3和P74组成的多分子复合物在ODV入侵昆虫中肠上皮细胞的过程中发挥重要作用.最近有研究报道其他囊膜蛋白如PIF4、PIF5和PIF6,可与已知的PIF互作促进ODV感染.进一步的研究发现,PIF4和P95(AC83)也是PIF复合物的组分,PIF4能与PIF1、PIF2、PIF3形成稳定的复合物,而P95和P74与这个复合物的结合并不紧密.通过蛋白质组分析发现,其他3种蛋白质——AC5、AC68 (PIF6)和AC 108(SF58的同系物)也与PIF复合物有关.揭示ODV入侵昆虫中肠上皮细胞时复合物的形成与构象变化,PIF的潜在受体及其复合物识别宿主细胞受体的过程,将是阐明杆状病毒PIFs及其复合物介导ODV病毒感染机制的重要研究内容....
[专利] 发明专利 CN201510060324.9
浙江大学 2015-05-20
摘要:本发明公开了一种可视化红色荧光杆状病毒的构建方法,即:在杆状病毒的核衣壳蛋白的羧基末端融合1~3个分子的红色荧光蛋白,由此重组得到可视化红色荧光杆状病毒。本发明通过红色荧光蛋白标记病毒的核衣壳蛋白,使病毒带有红色荧光从而可视化,由此可根据红色荧光的出现判断病毒的位置,追踪杆状病毒粒子的行踪。本发明重组病毒的构建为探究杆状病毒在培养细胞和幼虫组织中的详细侵染过程创造了条件。
[成果] 1800110463 浙江
S884 基础研究 其他畜牧业 公布年份:2017
成果简介:该研究利用抗BmP95的特异性抗体,分别对提取纯化的BV和ODV的核衣壳和囊膜进行了Western Blotting分析,在提纯的ODV囊膜泳道中出现了特异性条带,而在ODV核衣壳和BV中未检测出阳性条带,因此BmP95蛋白是ODV囊膜的特异性蛋白。进而利用Far-western和shotgun技术对PM进行了质谱分析,共鉴定到了14种蛋白质。功能分析发现其中大部分蛋白与催化活性、结合活性和转运活性有关,且参与代谢过程和先天免疫途径。进一步对新发现的BmPM-24进行了研究,结果显示BmPM-24 cDNA ORF长684 bp,编码227个氨基酸残基,在其N端含有15个氨基酸残基的信号肽序列;Western Blotting结果显示在中肠和PM中均能检测到特异性条带;qRT-PCR结果显示BmPM-24基因主要在中肠、脂肪体和马氏管中表达;亚细胞定位结果表明BmPM-24蛋白主要分布在细胞膜附近区域;BmPM-24基因mRNA的表达水平可被细菌和病毒显著地诱导激活;BmPM-24基因缺失家蚕突变体的生物学试验显示,经口感染能力显著下降。 研究结果有助于阐明杆状病毒的入侵机制及规律,并为设计抗家蚕BmNPV病毒入侵的有效药物提供新思路,同时也为有效控制农业害虫提供参考策略。
[专利] 发明专利 CN201310342863.2
浙江大学 中国丝绸博物馆 2014-01-15
摘要:本发明公开一种利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法,合成序列为“CGYGAGAGAGYGA”的多肽,将多肽和匙孔血蓝蛋白偶联起来得到完全抗原;用生理盐水稀释完全抗原,将稀释后的完全抗原与完全弗氏佐剂混合,然后乳化处理得到初次免疫抗原乳化液;使用初次免疫抗原乳化液对兔子进行初次免疫,然后对兔子进行加强免疫,加强免疫使用的是加强免疫抗原乳化液;加强免疫抗原乳化液是由稀释后的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合,然后乳化处理得到;当兔子的抗血清效价达到1/10000时,收集免疫后的兔子的血液,并使血块充分收缩及抗血清完全析出,收集抗血清并离心处理得到上清液。本发明方法制备的抗体具有很强的特异性,能用于纺织品等成分中的丝素蛋白的检测分析。
[专利] 发明专利 CN201210368635.8
浙江大学 2013-02-06
摘要:本发明公开了一种家蚕BmNPV多角体晶体固定蝎毒素蛋白的方法,包括:(1)进行蝎毒素蛋白BmK基因的克隆;(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化所述pCR2.1-BmK基因得到BmK基因片段,然后将BmK基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体;将所述重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPVDNA共转染入家蚕培养细胞,并通过同源重组产生含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒;(3)使用家蚕培养细胞,接种所述含有蝎毒素蛋白基因的重组杆状病毒和野生型病毒BmNPV,在27℃下感染三天以进行感染表达,后通过离心收集家蚕培养细胞。本发明解决了蝎毒素蛋白容易失活的缺点,为开发蝎毒素蛋白作为生物杀虫剂创造了条件。
[专利] 发明专利 CN201210420392.8
浙江大学 2013-01-23
摘要:本发明公开了一种重组家蚕杆状病毒经皮感染家蚕的方法:将家蚕幼虫集中于饲养框内;以100头家蚕幼虫喷射5ml重组家蚕杆状病毒液为标准,将含有106pfu的重组家蚕杆状病毒液喷射于家蚕幼虫的体表;喷射后1小时内不饲喂桑叶,待大部分病毒液干燥后,按照常规方法饲养家蚕幼虫,直至家蚕幼虫出现病毒感染症状。本发明方法的优点在于改变了传统直接使用经皮感染的接种方式,简化了接种操作,节省了接种时间,提高了昆虫杆状病毒表达系统的工作效率。
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