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摘要:水霉病由水霉菌引起,能感染包括鱼类、两栖类在内的多种水生动物,严重损害水产养殖行业的经济利益.由于水霉菌具有多宿主、生命力顽强的特点,及时监测水体中水霉菌及其孢子的浓度成为预防水霉病的重要方面.本研究利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了水霉菌LAMP检测方法,并在实际生产中进行了临床应用.结果表明:在链置换聚合酶(Bst酶)的作用下,62℃扩增60 min,扩增结果可用琼脂糖凝胶电泳或荧光染料两种方式观察得到,最低可检出102个拷贝,具有较高的特异性.利用该方法对某林蛙养殖场的蝌蚪池水霉菌进行检测,结果为阳性,证明该养殖场的蝌蚪池中存在水霉病暴发和传播的风险....
摘要:由于环境、气候的恶化以及疾病的侵害,全球两栖动物种群数量呈现出整体衰退的趋势,其中虹彩病毒属蛙病毒科的蛙病毒是不可忽略的原因之一.环介导等温扩增技术(loop-mediated-isothermal-amplification,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术,具有特异性强、快速、简便等特点,本研究利用LAMP技术,开发了针对中国东北林蛙种蛙蛙病毒的快速检测方法,针对蛙病毒MCP基因设计出能特异识别靶序列上6个位点的4条特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)的作用下,62℃扩增30 min.通过对实验参数的优化,扩增后病毒的最低检出数可达到102个拷贝.该方法可用于东北林蛙养殖厂种蛙蛙病毒的临床快速检测,保证种蛙的存活质量和数量....
[博士论文] 汪环
自然保护区学 东北林业大学 2018(学位年度)
摘要:近年来,由蛙病毒引起的两栖类、鱼类和爬行类动物疾病已在全球范围内普遍流行,由于其宿主种类广泛、发病率和死亡率高,蛙病毒也是造成多种两栖动物的种群数量突然下降,甚至灭绝的重要原因。蛙病毒属可感染的宿主类型广泛,可感染鱼类、爬行类以及两栖类动物等多种经济及药用动物,给这些动物的野外种群和养殖产业带来了严重的危害,并且,蛙病毒感染后发病迅速、病程短,一旦发病死亡率可达到100%,值得注意的是,目前世界上还尚未开发出针对蛙病毒有效的治疗办法。
  鉴于蛙病毒感染的严重危害,世界动物卫生组织(OIE)已将蛙病毒感染列入必须通报的名单中。而中国作为世界上两栖类资源最为丰富的国家之一,目前已经在大鲵、东北林蛙等一些珍贵物种中检出蛙病毒的感染病例,因此在蛙病毒引起全球两栖类种群数量急剧下降的国际背景下,中国两栖类种群防治蛙病毒的防治工作也亟待更加广泛地发展起来。
  本研究利用病理学、细胞学、分子生物学以及高通量测序等技术手段,针对中国黑龙江地区东北林蛙所携带的蛙病毒开展了一系列的研究,从病毒的分离培养等特性研究,到东北林蛙感染蛙病毒后体内发生的转录组学分析,最后有针对性地对两种抗病毒中药制剂对于蛙病毒感染的体内外作用进行了研究;不仅充分了解了中国黑龙江地区东北林蛙携带的蛙病毒特性,并为研究蛙病毒感染引起的宿主免疫反应补充了转录组学研究,为诊断、防治蛙病毒奠定了基础,对于保护本地区冷血脊椎动物种群的生态健康具有重要的意义。
  1.东北林蛙野外种群携带的蛙病毒分离及培养
  利用本研究建立的蛙病毒PCR和LAMP快速检测方法,对中国黑龙江地区蛙病毒曾出现过的区域进行了东北林蛙野外种群蛙病毒的分布调查,选取了鹤北、黑河和东方红林场共3个采样地,检测了林蛙肝脏组织样本511份,得到了5份蛙病毒阳性样本。再根据OIE标准推荐的蛙病毒分离及鉴定方法,对检测到的蛙病毒进行了鉴定和分离:针对阳性样本的测序结果,利用蛙病毒MCP基因进行了多序列比对及系统发育进化树分析,发现检测得到的阳性样本与FV3序列一致性为99%,在分类地位上更近,确认该阳性样本属于蛙病毒属病毒;利用EPC细胞系对该病毒进行了分离和研究,经细胞培养和病毒滴度测定,得到了滴度为107.231TCID50的蛙病毒;在电镜下观察到了大量蛙病毒粒子,镜下蛙病毒粒子呈六边形,大小在140~190nm之间,并且在细胞中可观察到蛙病毒粒子复制中的形态:在细胞质中可见其病毒装配区,其中可见等待装配的病毒囊膜,装配完成的病毒粒子在细胞中呈整齐的晶格状排列,并可观察到部分成熟的蛙病毒粒子以出芽方式从细胞中释放。
  2.蛙病毒胁迫下东北林蛙肝脏的转录组研究
  利用高通量转录组测序和De Novo转录本拼接技术,首次得到了东北林蛙肝脏的转录本信息,共153,979条基因序列,并对这些基因进行了基因注释及对应的生物功能分类;通过比较转录组学,对蛙病毒胁迫下东北林蛙体内的差异表达基因及其参与的信号通路进行了分析,共得到了58个差异表达的基因,包括了部分重要的免疫相关基因MHC-Ⅰ、TGFBR2和PARP等,以及这些差异基因参与的41条信号通路,其中包括MARP通路、TGF-β通路、抗原加工和递呈通路等重要的免疫相关通路;在实验室独立感染实验中,利用qPCR的方法对蛙病毒胁迫下东北林蛙肝脏转录组的结果进行了验证,选取了6个差异表达基因,对其mRNA的表达变化进行了验证,结果符合转录组的结论,证明本研究的转录组结果可信;并且,对发现的3个免疫相关基因在蛙病毒感染的不同时间点和不同组织中的mRNA表达变化进行了研究和分析。通过上述研究,对东北林蛙感染蛙病毒后体内发生的免疫应答及信号通路变化情况有了深入的了解,为研究蛙病毒感染宿主的机制以及引起的免疫反应提供了研究思路和基础。
  3.两种常用抗病毒中药制剂的抗蛙病毒作用研究
  由于目前尚未发现有效的防治蛙病毒的药物,本研究利用建立的蛙病毒体内和体外感染模型,对两种抗病毒中药制剂(黄芪多糖和板蓝根注射液)的抗蛙病毒效应进行了评估。在蛙病毒感染EPC细胞的体外模型中,利用CCK8和细胞凋亡流式检测的方法,对两种药物的不同浓度及不同方式(预防和治疗)的抗病毒效应进行检测,结果发现,较高浓度(30mg/mL)的板蓝根注射液以预防和治疗两种方式干预后,EPC细胞的存活数增加,并且凋亡率明显下降,而黄芪多糖注射液干预后,EPC细胞的存活数量未增加,细胞凋亡率增加;而在实验室动物感染实验中,利用qPCR检测林蛙体内的蛙病毒载量变化以及相关免疫基因的mRNA变化,结果发现,板蓝根注射液在治疗蛙病毒感染中,显著降低了组织内蛙病毒的感染载量,而黄芪多糖注射液在预防组和治疗组都显著降低了蛙病毒的感染载量;在免疫基因mRNA表达检测中,板蓝根使得大多数的免疫因子表达增加,而黄芪并未出现增强免疫因子表达的作用。
[专利] 发明专利 CN201410631647.4
东北林业大学 2015-01-21
摘要:本发明蛙疱疹病毒1型的LAMP快速检测方法及试剂盒,属于农业科学生物技术应用领域。所述快速检测方法,包括下述步骤:(1)提取待测样本总的DNA核酸作为反应模板;(2)配置LAMP反应溶液,其中LAMP反应溶液由下列体积比的组分组成,Bst DNA聚合酶:水霉菌:灭菌水:2×反应缓冲液:引物混合物=1:2:8.6:12.5:0.9;(3)将步骤(1)提取的样本总DNA加入到步骤(2)配制的LAMP反应溶液中,混合;(4)在60℃恒温水浴中反应30分钟;(5)诊断结果:将步骤(4)扩增反应后产物用电泳检测或荧光染料技术进行鉴定。本方法具有操作简单、低成本,反应快速、特异性强、灵敏度高的优点,且用时短,灵敏度比普通PCR高100倍,对壶菌早期诊断准确性更高的特点。
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