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摘要:为了深入研究鸡胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向雄性生殖细胞分化过程,基于RNA-Seq基础,筛选出功能未知且差异极其显著的关键基因C1 EIP,PCR克隆得到其编码区全长序列409 bp,构建其真核表达载体pcDNA3.0-C1EIP和pEGFP-C1 EIP,实现C1EIP在真核细胞内的定位表达,并以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP后免疫小鼠制备抗血清.间接免疫荧光检测抗血清效价为1∶10,RT-PCR和Western blot证实C1EIP真核表达载体成功表达且抗血清效果良好,为C1 EIP基因在ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的功能研究奠定了基础....
摘要:本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目的基因定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据.基于NCBI数据库提供的CDS序列克隆C2EIP (chr2,Expression In PGC)基因全长,并根据基因序列中APM的位置设计特异性gRNA1、gRNA2和gRNA3,并构建cas9/gRNA载体;将设计好的cas9/gRNA转染状态良好的DF-1,利用Luciferase SSA重组检测法、T7E1酶切法以及TA克隆测序法检测gRNA在DF-1细胞中基因的敲除效率.Luciferase SSA重组检测结果表明,只有cas9/gRNA3载体具有基因敲除活性,荧光活性比对照组高两倍,T7E1酶切结果显示cas9/gRNA3基因的敲除活性为27%,TA克隆测序结果表明,30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%.通过本研究在家鸡中初步建立了cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在鸡的细胞DF-1上介导基因敲除....
摘要:试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果.首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测.结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞.实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、inte grinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组.睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础....
摘要:试验旨在探究不同注射部位和剂量对鸡胚孵化率及发育的影响,为鸡胚注射试验提供帮助和指导.以新鲜受精鸡蛋为材料,分别在鸡蛋的尖端、赤道面和钝端注射不同剂量的生理盐水,比较不同注射部位和剂量对种蛋孵化率的影响;分别在3个位置注射台盼蓝染液,观察记录鸡胚的发育情况.结果表明:不同注射部位对种蛋孵化率无显著性影响(P>0.05);种蛋孵化率随注射剂量的增加明显下降,注射100 μL剂量的种蛋孵化率明显高于其他剂量水平.不同注射位置和剂量的生理盐水对鸡胚发育的影响并不显著;台盼蓝注射后胚胎发育情况表明,在胚胎发育初期赤道面注射的扩散效果最好....
摘要:本研究利用精原干细胞介导法体内转染重组载体pVITRO2-Mx-NA以生产抗病转基因鸡.采用睾丸注射法将脂质体包裹的线性化质粒通过随机打点注射入公鸡睾丸,采集25、50、60、70d后试验公鸡的精液,提取基因组DNA,采用常规PCR检测外源Mx-NA联合基因的整合;转染后60d采集阳性公鸡精液人工授精母鸡,采用PCR和Western blot方法检测后代血液中外源NA-Mx联合基因的表达情况.结果表明:PCR检测证实外源Mx-NA联合基因已在精子基因组中表达,精液PCR阳性率为33.33%(2/6),且能通过体外受精在后代中检测到,后代PCR检测的阳性率为31.43%(11/35),Western blot检测F1代阳性率为28.6%(10/35).以上结果证明外源Mx-NA基因能稳定整合到鸡的基因组中,表明睾丸注射法是一种操作简单、有效的制备抗病转基因鸡的方法....
[专利] 发明专利 CN201810889239.7
扬州大学 2018-12-18
摘要:本发明属于动物育种学和细胞生物学领域,具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法,包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术,能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行,可重复性强,在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。
[专利] 发明专利 CN201810916667.4
扬州大学 2018-12-07
摘要:本发明属于动物育种学和细胞生物学领域,涉及一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法,包括如下步骤:Stra8基因3’UTR序列的获得;Stra8基因靶向miRNA预测;最佳miRNA筛选;验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用;体内验证miRNA对公鸡生精的影响。相对于现有技术,本发明本方法简单易行,可重复性强,在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证Stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对Stra8基因进行抑制,以便更好在SSC中进行基因功能验证。
[硕士论文] 汪怡临
动物遗传育种与繁殖 扬州大学 2018(学位年度)
摘要:原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)作为配子的祖先细胞,是生殖细胞发育过程中必不可少的。研究PGCs的发生和分化机理对动物种质资源保存、创新利用以及基因修饰鸡的生产等领域具有重要理论和实践意义。
  PGCs的发生受到许多因素的影响。目前,研究者们已经发现一些关键性的基因、信号通路、生长因子和表观遗传修饰因素对PGCs的发生起重要调控作用。尽管这些因素对于PGCs形成起到了一定的促进作用,但体外诱导PGCs的生成效率并没有得到提高。因此,亟需从新的领域对PGCs的生成机制进行创新性地探究,深入了解和认识PGCs的形成过程,以期获取能够满足生产研究所需的大量PGCs细胞。
  随着测序技术和生物信息分析技术的发展,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在生殖细胞分化与胚胎发育过程中的作用逐渐受到重视。研究lncRNA对PGCs发生的影响及机制,能够为提高PGCs体外生成效率提供新的研究策略。本研究基于前期单细胞高通量测序结果筛选得到鸡PGCs特异表达lncRNA-M1ANCR,利用RNA干扰技术,以家鸡为研究对象,从体内和体外两个水平探究了lncRNA-M1ANCR在PGCs发生过程中的功能和机制,为有效提高PGCs效率提供理论依据和参考。研究结果如下:
  (1)lncRNA-M1ANCR的全长扩增,细胞定位与编码能力鉴定:基于前期高通量测序筛选得到PGCs特异性表达lncRNA,命名为lncRNA-M1ANCR,通过RACE实验扩增获得lncRNA-M1ANCR全长(共计1115bp),qRT-PCR验证了lncRNA在PGCs中特异性高表达(ESCs:1.021±0.231,PGCs:5.131±1.23,SSCs:1.825±0.828),与转录组测序(ESCs:1.143±0.350,PGCs:37.131±1.053,SSCs:6.825±0.923)结果一致,细胞定位监测发现lncRNA-M1ANCR定位于PGCs细胞质中(细胞核:0.773±0.051,细胞质:3.395±0.583);生物信息学预测发现lncRNA-M1ANCR的4bp-115bp为开放阅读框序列,构建原核融合表达载体发现该序列在BL菌种中不表达蛋白,表明明lncRNA-M1ANCR不存在编码小肽能力。
  (2)体内外研究lncRNA-M1ANCR在PGCs形成过程中的功能:根据lncRNA-M1ANCR全长序列,设计三个shRNA靶位点,连入pGMLV-SC5干扰载体,转染DF-1细胞后通过定量检测发现3号靶位点的干扰效率(67.16%±2.0%)最高且显著高于对照组(P<0.01);同时,克隆lncRNA-M1ANCR全长,构建pcDNA-M1ANCR过表达载体;然后,将lncRNA-M1ANCR慢病毒干扰载体与过表达载体分别转染鸡ESCs,在RA诱导条件下,观察细胞分化形态的变化,结果发现,干扰lncRNA后,类PGCs形成数量(3±1/400×视野)较RA单独诱导组(10±2个/400×视野)和过表达组(12±2个/400×视野)显著减少;进一步采用qRT-PCR检测PGCs细胞特异性标记基因Cvh和C-kit的表达水平发现,干扰组的表达量(Cvh:1.029±0.062,C-kit:1.154±0.009)显著低于过表达组(Cvh:1.672±0.123,C-kit:2.232±0.029)和诱导组(Cvh:1.232±0.234,C-kit:1.561±0.017)(P<0.01),而全能性基因Nanog的表达(Nanog:1.029±0.024)则显著高于过表达组(Nanog:0.918±0.038)与诱导组(Nanog:0.984±0.033)(P<0.01);间接免疫荧光检测结果表明,干扰组Cvh的表达显著低于RA诱导组和过表达组;流式细胞检测发现,干扰组诱导4d后产生的类PGCs细胞(3.96%±0.32%)显著少于RA诱导组(9.67%±0.24%)和过表达组(12.1%±0.46%)(P<0.01);体内实验中,将干扰载体与过表达载体通过血管注射整合进入鸡胚后,检测生殖标记基因在PGCs的表达情况,发现均出现显著性下降(Cvh:2.631±0.208,C-kit:3.028±0.23)(P<0.01),同时通过石蜡切片观察PGCs细胞在生殖嵴的数量,发现干扰组PGCs的形成明显减少(15±0.57个);为进一步说明lncRNA对PGCs形成的影响,流式细胞分选仪检测干扰lncRNA后PGCs的形成被抑制(4.0%±1.1%),与体外诱导结果一致。结果表明,lncRNA-M1ANCR对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有正向调控作用。
  (3)lncRNA-M1ANCR启动子核心区域鉴定与转录因子分析:根据RACE结果预测lncRNA-M1ANCR启动子区域并构建真核表达载体p0-EGFP,转染DF-1细胞发现,克隆片段能够稳定表达绿色荧光,确定该区域具有启动子活性;分别构建启动子缺失载体pGL3-p1-783,pGL3-p2-530,pGL3-p3-269与pGL3-p3x后,转染DF-1细胞,进行双荧光素酶报告检测,结果表明,pGL3-p3-269的启动活性最高(4.39±0.35),说明在-269bp~-1bp中存在重要的调控作用元件,对启动子活性具有重要影响。进一步通过生物信息学分析获知,在启动子区域-269bp~-1bp间存在转录因子p53的结合位点,为探究p53对启动子活性是否具有调控作用,本研究构建了p53的干扰载体与过表达载体。分别转染DF-1细胞后检测缺失片段的双荧光素酶活性,发现干扰p53后核心区域的活性(1.65±0.53)显著低于正常组(4.06±0.41)和过表达组(4.55±0.66)。综上表明,转录因子p53能够调控lncRNA-M1ANCR启动子核心区域的活性,进而调控lncRNA的表达。
  (4)lncRNA-M1ANCR与gga-mir-1591竞争性结合抑制机制的初步探究:lncRNA具有潜在的ceRNA特性,本研究通过生物信息学分析得到与lncRNA-M1ANCR存在潜在竞争性结合关系的miRNA(gga-mir-1591,gga-mir-3539),分别构建miRNA的模拟物与抑制物,并在RA诱导条件下体外转染鸡ESCs细胞,通过细胞形态观察发现,抑制gga-mir-1591的表达能够促进类PGCs的形成,而模拟gga-mir-1591的表达则干扰类PGCs的形成,gga-mir-3593的模拟物与抑制物对类PGCs的形成无明显作用;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖标记基因的表达,发现转染gga-mir-1591抑制物后,MAPK1与lncRNA的表达显著上调(MAPK1:12.293±2.012,lncRNA-M1ANCR:2.137±0.324),生殖标记基因的表达量(Cvh:6.731±0.921,C-kit:6.631±0.918)也显著高于其他组别;为进一步验证gga-mir-1591对鸡PGCs形成的影响,本研究通过流式分析检测发现,抑制gga-mir-1591后,类PGCs的阳性细胞率(3.13±0.22%)显著高于其他组别(P<0.01),表明miRNA gga-mir-1591对鸡ESCs向PGCs的分化过程具有调控作用,与lncRNA-M1ANCR可能存在竞争性结合抑制关系。为进一步验证gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR之间的关系,本研究在转染gga-mir-1591模拟物与抑制物的基础上,分别转染了lncRNA-M1ANCR的过表达载体与干扰载体,通过拯救实验来验证两者之间存在的竞争性结合抑制关系。细胞形态学观察结果发现,抑制gga-mir-1591后类PGCs的形成能够受lncRNA干扰载体的影响,导致类PGCs形成减少,反之亦然;同时通过qRT-PCR检测lncRNA-M1ANCR,MAPK1,全能性基因以及生殖标记基因的表达发现,在抑制gga-mir-1591表达同时干扰lncRNA情况下,MAPK1的表达量较抑制gga-mir-1591组显著降低(P<0.01),生殖标记基因的表达也有显著下降(P<0.05);综上表明,gga-mir-1591与lncRNA-M1ANCR存在竞争性结合关系,lncRNA-M1ANCR通过“海绵样”吸附的方式,竞争性结合靶向作用于MAPK1的miRNA gga-mir-1591,调控MAPK1的表达水平,进而调控鸡PGCs的形成。
  (5)lncRNA-M1ANCR互作蛋白的筛选与鉴定:通过对lncRNA-M1ANCR的RNApull down结果分析得到,在鸡ESCs向PGCs分化过程中lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白存在潜在相互作用关系,为进一步验证两者之间的作用机制,本研究通过Western Blot实验确定了ILF3蛋白在鸡PGCs中存在表达,并通过RIP实验发现,ILF3与lncRNA间存在结合。为了进一步探究两者之间的互作关系,本研究对与ILF3与lncRNA相关的下游信号通路的关键节点基因进行了qRT-PCR检测,结果表明干扰lncRNA后,下游信号通路关键基因MAPK与Wnt(MAPK:10.342±1.192,Wnt:6.323±0.624)较过表达组(MAPK:14.432±1.394,Wnt:10.960±0.934)显著降低。综上表明,在鸡PGC的形成过程中,lncRNA-M1ANCR与ILF3蛋白间存在互作关系,并且lncRNA表达的变化能够影响下游信号通路关键基因的表达。
[专利] 发明专利 CN201610252399.1
扬州大学 2016-08-10
摘要:本发明公开了一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法,本方法首先从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睾丸,分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs,并根据CDH1基因设计特异性,以PCR扩增的方法进行性别鉴定,对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选,阳性细胞提取细胞总RNA,纯化后对RNA质量进行检测,检测合格后进行RNA‑Seq测序。将测序结果中筛选出组装RNA的转录本。分离鸡ESCs,PGCs和SSCs,提取总RNA,反转录为cDNA。对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析,并通过DAVID数据库查找其GO功能项,再通过GO分析注释其功能,对其进行功能分析。绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。
摘要:前言原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的始祖细胞,是精子和卵细胞的前体细胞,在动物胚胎的发育过程中起重要作用。而禽类中PGCs最早出现在上胚层,随着血循环系统的形成迁移进入了生殖嵴,并继续分化为精原干细胞(SpermatogonialStemcells,SSCs)及卵原细胞。在第28期(孵化132小时)时,PGCs大量位于生殖嵴之中,参与原始性腺的形成,此时对比两性间原始生殖细胞之间的差异研究对于揭示禽类性别分化和生殖细胞发生发育规律具有重要意义。
摘要:前言Cas9介导的基因编辑工具已经广泛的用于人、小鼠、斑马鱼等物种,而且在植物上也有广泛的应用,但是该方法在家禽中的应用尚未见报道。自1997年以来,本实验室一直致力于鸡的胚胎发育和鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的调控机制研究,已经完成鸡雄性生殖细胞发育分化过程中的转录组测序筛选到参与鸡雄性生殖细胞生成的关键基因和信号通路。为了进一步验证这些关键基因和信号通路的功能,在家鸡中建立有效的体外基因编辑系统就显得尤为迫切和必要。
摘要:[目的]本研究旨在家鸡上建立一种高效、稳定的基因组定点编辑技术体系,实现目基因的定点敲除,为后续家鸡基因编辑提供操作依据。[方法]基于NCBI 数据库提供的CDS 序列克隆C2EIP(chr2,Expression In PGC,C2EIP)基因全长,并根据基因序列中APM 的位置设计特异性gRNA1,gRNA2 和gRNA3 并构建cas9/gRNA 载体;将设计好的cas9/gRNA 转染状态良好的DF-1,利用luciferase SSA 重组检测法、T7E1 酶切法以及TA 克隆测序法检测gRNA 在DF-1 细胞中基因的敲除效率。
摘要:[目的]本研究旨在探寻参与调控鸡雄性性原细胞分化的关键基因和信号通路,以期提高雄性生殖细胞的体外诱导生成效率。[方法]采用流式细胞分选法获得纯化的鸡胚胎干细胞(Embryonicstem cells,ESCs)、原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(Spermatogonial Stem cells,SSCs),利用Microarray、RNA-seq 技术系统地分析了三种细胞的转录本差异,筛选出参与调控鸡雄性性原细胞分化的候选关键基因和信号通路;采用qRT-PCR 对上述结果进行验证。
摘要:本文旨在探索鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向精原干细胞(Spermatogonia stem cell,SSC)分化过程中关键lncRNA 及靶基因,并探究其作用机制,为ESC 体外向SSC 诱导分化体系提供新的依据。以RNA-Seq 技术对鸡ESC、原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGC)和SSC进行测序与分析,筛选出显著性差异以及特异性表达的候选lncRNAs,以qRT-PCR 对候选lncRNAs在三种细胞中表达趋势变化进行验证,通过BLAST 和RNAplex 软件对候选lncRNAs 进行靶基因预测,同时以DAVID 数据库、WEGO 以及STRING 等在线软件进行功能和蛋白网络互作分析。
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