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[专利] 发明专利 CN201710812983.2
东南大学 2017-11-21
摘要:本发明公开了一种调控细胞内NF‑κB活性的基因表达载体及其调控方法和应用,该载体包含两个序列元件,调控基因表达的启动子序列和启动子下游miRNA编码序列;所述启动子序列由一段NF‑κB诱骗子序列和最小启动子序列组成;所述miRNA编码序列为一段可编码靶向NF‑κB mRNA的miRNA的编码序列。该基因表达载体的转染可温和而有效地降低NF‑κB活性过度活化的细胞内的NF‑κB活性,且对正常细胞的活力无明显影响,从而避免副作用。本发明的基因表达载体的调控方法简单、快速、有效;该基因表达载体用于制备基因治疗NF‑κB过度活化密切相关疾病的NF‑κB活性调控试剂或药物分子,作为一种新的基因治疗试剂。
[硕士论文] 汤缓缓
生物医学工程;生物物理学 东南大学 2017(学位年度)
摘要:NF-κB是一类广泛存在于多种细胞中的转录因子,参与调控炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等多种生理过程。当细胞受到刺激时NF-κB会被激活,活化的NF-κB与其顺式调控元件特异性结合,从而调节下游基因的表达。研究表明许多疾病的发生都与NF-κB及其信号通路的异常活化有关,NF-κB已成为疾病治疗和新药开发的重要靶点,因此针对NF-κB活性抑制剂的研究具有重要的生物医学应用价值。
  本论文利用NF-κB特异启动子和干扰NF-κB活性的miRNA共同构建一种NF-κB活性自控型分子,来调控细胞内NF-κB的活性。
  第一步,选择NF-κB家族的RelA基因作为靶点,设计并合成3对针对RelA基因的人工miRNA基因序列,将其连入到miR-155骨架中,构建稳定表达人工miRNA的干扰载体。通过与携带靶基因的报告载体的共转染实验,筛选出一个对NF-κB活性干扰效果最好的miRNA,即amiR533。
  第二步,基于NF-κB诱骗子策略设计NF-κB特异调控元件,将其与最小启动子一起构成一种NF-κB特异启动子。通过构建NF-κB特异启动子载体及转染实验,证明NF-κB特异启动子的转录活性显著受细胞内NF-κB活性的调控,而且此启动子上的NF-κB特异调控元件也可以作为NF-κB的诱骗子发挥其作用。
  第三步,用NF-κB特异启动子构建amiR533表达载体,制备一种细胞内NF-κB活性自控型分子。通过与携带靶基因的报告载体的共转染实验,证明NF-κB活性自控型分子对细胞内NF-κB活性的调控作用,且其调控活性远较常用强启动子CMV温和。NF-κB活性自控型分子功能的强弱取决于细胞内NF-κB的活性,既可抑制NF-κB过度活化,还可以避免损害NF-κB的正常生理功能。
  第四步,用NF-κB活性自控型分子转染HepG2细胞,通过荧光定量PCR检测细胞内NF-κB自身及其靶基因的表达水平。结果表明,NF-κB活性自控型分子既可以降低NF-κB自身表达,也可以降低NF-κB靶基因的表达。用NF-κB活性自控型分子转染293T和HepG2细胞,结果显示两种细胞的总凋亡率都相对较低,表明NF-κB活性自控型分子对两种细胞的细胞活性影响较小。
  因此,本研究构建的NF-κB活性自控型分子可以自控调节细胞内NF-κB的活性,温和抑制NF-κB及其靶基因的表达,但对细胞活性不产生显著影响。
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