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[硕士论文] 汤玲
生物化学与分子生物学 安徽大学 2018(学位年度)
摘要:胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)是一种从囊胚时期内细胞团(Inner cell mass,ICM)中经分离培养的具有多潜能性的细胞。自我更新(Self-renewal)和多向分化(Differentiation)是其重要的两大生物学性质。因此,它已成为筛选药物和制造疾病动物模型的有力工具之一。小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cells,mESCs)自1981年成功建系以来,就已经成为研究者应用最多的理想实验模型之一,近些年的不断探索发现,胚胎干细胞的广泛应用为我们研究哺乳动物胚胎发育机制、细胞组织的定向分化提供了广泛的思路,也为医学和生物学的研究发展做出了巨大贡献。
  目前,mESCs自我更新性质的维持可通过两种方法培养,其中比较经典的是LIF/Serum的培养条件。我们将LIF(Leukemia inhibitor factor)这种白血病抑制因子添加到培养液中后,会激活LIF介导的信号通路,从而活化这条信号转导系统中的一系列基因,它们共同发挥作用将mESCs维持在自我更新的状态,并具有保持其多向分化的能力。有文献报道,Sp5是LW/STAT3信号通路中STAT3下游的直接靶基因,在无LIF的培养条件下,上调Sp5的表达可以将mESCs维持在不分化的状态,但Sp5是怎样发挥这项功能的,到目前为止,还不清楚。所以,为了进一步探究Sp5维持mESCs未分化的具体分子机制,完善这条信号转导通路,使人们更好的理解mESCs自我更新与分化的关系,我们研究方向就明确了。本实验主要分两大部分进行:其一,筛选Sp5下游的直接靶基因;其二,对筛选的靶基因和Sp5自身的结构展开一系列的功能性验证实验。
  首先,为了筛选出这些基因,我们利用PiggyBac(PB)载体成功构建了带有HA标签的过表达Sp5(PB-Sp5)的46C细胞系。因为之前有文献报道,过表达Klf2/4/5,Nanog,Gbx2,c-Myc,Tfcp2l1,Tbx3基因[9-20],可以在无LIF的培养条件下维持mESCs自我更新,为了探究Sp5是否通过这些基因将mESCs维持在不分化的状态,在过表达Sp5的实验组及其对照组的mESCs中,我们用qRT-PCR在转录水平上分别检测以上基因的相对表达量,结果显示Nanog和Klf2的表达量明显升高。为了进一步确定Sp5的候选基因,我们又构建了Sp5敲低和敲除细胞系,同样用qRT-PCR在转录水平上检测Nanog和Klf2的表达量,最终确定Nanog是Sp5的靶基因。除此之外,结合染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告系统实验显示,Sp5直接调控Nanog的启动子。
  紧接着我们做了一系列的功能性验证实验。看看Sp5到底是不是通过Nanog发挥其维持mESCs自我更新作用的。首先,我们检测Nanog的下调是否对Sp5维持mESCs自我更新的能力产生影响。我们在上调Sp5的细胞系中下调Nanog,将其置于没有LIF的培养基下培养8天,结果发现:(1)没有下调Nanog的对照组细胞能维持较好的干细胞形态,有较高的碱性磷酸酶活性,且高表达胚胎干细胞标志性因子OCT4和SSEA1,而下调Nanog的实验组细胞则分化了。(2)实验组相比较对照组,高表达和分化相关基因,低表达和自我更新相关基因。这些结果都表明:Sp5是通过调控Nanog的表达来维持mESCs不分化形态,换句话说,下调Nanog会损害Sp5维持mESCs自我更新的能力。
  Sp5除了通过调控Nanog的表达发挥功能外,其自身的Zn指结构可能对其发挥作用也产生影响。因为Sp5C端含有3个保守的类似于KLF家族的Zn指结构[21,22]。研究表明,KLF家族(Klf2/4/5)的3个Zn指结构对其维持mESCs自我更新的功能至关重要[23,24],缺失其中任何一个Zn指结构都会影响其发挥功能。于是我们就猜想Sp5的3个Zn指结构是否也具有和KLF家族中(Klf2/4/5)相类似的功能呢?为了验证这个猜想,我们用Over-lap PCR分别构建了缺失不同Zn指结构过表达Sp5的缺失突变体细胞系,在无LIF的培养条件下培养时显示:和过表达野生型的Sp5的细胞比较,(1)缺失突变组产生较少的典型胚胎干细胞及AP阳性克隆数。(2)Nanog表达量相对减少。这些结果均说明:3个Zn指结构对于维持完整的Sp5活性至关重要,缺失其中任何一个Zn指结构都会削弱Sp5发挥其维持mESCs自我更新的能力。
  我们的研究结果表明,Nanog是Sp5下游的直接靶基因,Sp5通过Nanog和自身的Zn指结构发挥其维持mESCs自我更新的功能。实验结果扩大了人们对维持mESCs多能性调控网络的认识,有利于后面的科研工作者对其进一步展开研究。
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