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[硕士论文] 殷香丽
作物遗传育种 华南农业大学 2017(学位年度)
摘要:酸性土壤上铝毒害是限制大豆生长和产量的重要因素之一。南方野生大豆比栽培大豆具有更广泛的遗传多样性,对酸铝胁迫具有较强的适应性,其中有多种基因参与大豆对酸铝胁迫的应答。本研究利用野生大豆耐酸铝基因表达谱,克隆到酸铝诱导表达上调的GsMYB7基因进行组织表达模式分析、生化特性分析和耐酸铝功能验证。主要研究结果分述如下:
  GsMYB7基因全长编码序列2179bp,编码区(coding DNA sequence,CDS)序列长度为1002bp,编码333个氨基酸。在GsMYB7起始密码子上游1500bp的核苷酸序列区间含有与光、乙烯、生长素、热、逆境响应等相关的应答元件,如AE-box、ERE、TGA、HSE、TC-rich重复序列等。蛋白质结构预测表明,GsMYB7蛋白具有R2R3 MYB转录因子的典型特征,含有2个保守的结构域,分别位于10-60和70-120的位置。系统进化分析显示,GsMYB7与拟南芥(Arabidopsis thalianaColumbia)中的R2R3 MYB类蛋白亲缘关系较近。
  将GsMYB7基因编码序列插入到pYL322-d1载体GFP序列的下游,利用拟南芥原生质体进行亚细胞定位。结果显示,GsMYB7蛋白定位在细胞核中。将GsMYB7基因序列插入到pGBKT7载体的限制性内切酶NcoI和BamHI之间,并转化酵母。实验结果表明,GsMYB7蛋白具有转录激活活性。
  设置0、15、30、50、75、100μM(pH4.5)AlCl3溶液浓度梯度,处理野生大豆BW69株系的幼苗,定量RT-PCR的结果表明,GsMYB7基因在根中上调表达,在AlCl3溶液为75μM时GsMYB7基因的相对表达量达到最高。
  将含有35S-GsMYB7-NOS的DNA序列插入到pZY101多克隆位点限制性内切酶HindIII位点处,以华春6号为受体材料并采用农杆菌介导大豆子叶节法进行大豆遗传转化,获得GsMYB7基因转化体,经加代繁殖、分子鉴定后获得7个过表达转基因株系。采用华春6号、GsMYB7转基因T4代过表达株系进行酸铝胁迫处理,测定结果表明,GsMYB7转基因株系的相对根伸长、相对总根长、相对根系总表面积、相对根体积,均显著大于野生型。在30μMAlCl3处理下,GsMYB7基因在转基因株系中较野生型表达量高,最高可达到2倍左右。
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